火麻籽多肽對高脂飲食喂養大鼠血脂的影響

魏連會，宋淑敏,，董 艷，石 杰，王嬌嬌，李寶龍，孫興榮

（1.黑龍江省科學院大慶分院，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江中醫藥大學基礎醫學院，黑龍江 哈爾濱 150040；3.黑龍江省農業科學院大慶分院，黑龍江 大慶 163316）

慢性病已成為現代人類健康的頭號威脅，高脂血癥是脂質異常的一種很常見的慢性疾病，能夠誘發如動脈粥樣硬化、冠心病、脂肪肝、中風、糖尿病、高血壓、心臟猝死等一系列疾病[1-3]。高脂血癥引起的心腦血管疾病，發病率高，危害大，2008年，全世界約有1 730萬 人死于心血管疾病，占全球死亡人數的48%，預計到2030年心血管疾病死亡率將達到2 330萬 人[4-6]。

高脂血癥極大威脅著人們的健康。目前，國內外的幾個經典降脂藥物，如他汀類、膽汁酸螯合劑、3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A（3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A，HMG-CoA）還原酶抑制劑、纖維酸類、煙酸及其衍生物在臨床中廣泛應用[7]。這些降脂藥物效果顯著，但這些藥物的使用對病人產生了一些副作用，其中包括骨骼肌毒性、皮膚過敏、腎功能受損、肝臟毒性、胃腸不適，因此急需開發新的降脂療法，以減小對病人的傷害[8]。

目前，利用天然食品原料防治高脂血癥的應用方面已有許多研究，天然食品中特效功能成分可有助于防病、治病[9-11]。從藥食同源植物中提取功能活性物質用于血脂異常疾病的治療，在醫藥、保健品領域受到了廣泛的關注。從天然產物中獲取具有降脂功能的活性物質用以預防和輔助治療高脂血癥可大大減少目前利用降脂藥帶來的副作用，具有重要意義。

生物活性肽具有易吸收、黏度低、低致敏性、加工性好等特點，目前已成為大健康時代的生物活性成分主角之一[12-13]。生物活性肽具有降血壓、抗氧化、免疫調節、抗菌、抗血栓、促進礦物質吸收、降血脂等功能活性[14-16]。近年來新型的蛋白質多肽的降脂療效被大量報道，如大豆多肽[17]、乳清蛋白肽[18]、糙米蛋白肽[19]、蕎麥肽[20]、花生肽[21]、海馬膠原蛋白肽[22]、卵黃蛋白肽[23]等，研究其降血脂活性及其相關機理，取得了一定的進展。

火麻（Cannabis sativaL.subsp.sativa）也稱為漢麻、大麻、線麻、黃麻等，在中國和加拿大廣泛種植，是一種重要的食品、纖維和醫藥植物。目前我國種植的大麻為無毒品種，四氫大麻酚質量分數低于0.3%。目前火麻籽已被開發成化妝品、醫藥食品、營養食品、功能保健食品[24]。火麻籽是火麻纖維化利用后的副產物，含有30%以上的油脂和25%以上的優質蛋白[25]。火麻籽中含有多種不飽和的脂肪酸，特別是亞油酸（ω-6）和亞麻酸（ω-3）含量豐富。火麻籽蛋白含有所有必需氨基酸，其中精氨酸含量特別豐富，達到了世界衛生組織規定的嬰幼兒對必需氨基酸的需求標準，是一種優質的蛋白質[26]。火麻籽的藥學功效在2000版的《中華人民共和國藥典》和2001年“藥食同源”名單均有記載[27]。目前已有學者對火麻籽分離蛋白的理化性質和功能特性進行了評價，并與大豆分離蛋白進行了比較，與大豆分離蛋白相比，火麻籽肽中的賴氨酸、異亮氨酸和苯丙氨酸的含量較低，而其他必需氨基酸的含量略高于或近似于大豆分離蛋白中的含量。此外，用不同的蛋白酶水解得到的火麻籽多肽被報道具有抗氧化性能[28]，抗氧化肽在慢性病的預防和治療方面存在的潛在貢獻，然而，關于火麻籽多肽在降血脂方面的研究卻鮮見報道。本實驗研究了火麻籽多肽對高血脂大鼠的降血脂及保肝作用，為火麻籽的開發利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

健康SD大鼠，雄性，SPF級，體質量（200±20）g，購自遼寧長生生物技術股份有限公司，生產許可證號：SCXK（遼）2015-0001，使用許可證號：SYXK（黑）2018-007。

火麻籽多肽粉由黑龍江省科學院大慶分院自制；基礎飼料 北京科澳協力飼料有限公司；高脂飼料（SCXK（京）2018-0006） 小黍有泰（北京）生物科技有限公司。基礎飼料配方：20%酪蛋白（質量分數，下同）、0.3%胱氨酸、39.7%玉米淀粉、13.2%麥芽糊精、10%蔗糖、5%纖維素、7%豆油、0.0014%叔丁基氫醌、3.5%礦物質、1.0%維生素、0.25%膽堿酒石酸鹽。高脂飼料配方：20%酪蛋白、0.3%胱氨酸、29.1%玉米淀粉、10%麥芽糊精、5%纖維素、2.5%豆油、1.0%礦物質、1.0%維生素、0.1%膽堿酒石酸鹽、20%豬油、1.3%磷酸二鈣、1.65%酒石酸氫鉀、0.55%碳酸鈣。

谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）檢測試劑盒南京建成生物研究所。

1.2 儀器與設備

cobas c311全自動生化分析儀 瑞士羅氏公司；08-2G磁力攪拌器 上海梅穎浦儀器有限公司；JA5003型分析天平 上海柯祁儀器設備有限公司；DT1001型電子天平 東儀精密儀器中國有限公司；VFD-6000真空冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 火麻籽多肽的制備及分離純化

按照本實驗室的方法制備火麻籽多肽[24]：稱取一定質量的火麻籽粕，按照火麻籽粕與水的質量比為1∶5加入蒸餾水溶解，按照終質量濃度30 g/L和4 g/L分別添加中性蛋白酶和木瓜蛋白酶在70 ℃、pH 5.0條件下酶解3 h；酶解后95 ℃水浴滅酶15 min，10 000 r/min離心15 min，分離取上清液，得到火麻籽多肽混合液。將酶解得到的火麻籽多肽混合溶液通過切向流膜過濾系統進行分離純化，采用截留分子質量為1 kDa過濾膜過濾，收集分子質量小于1 kDa火麻籽多肽，用真空冷凍干燥機凍干備用。

1.3.2 大鼠分組及處理

屏障系統內飼養室溫度為20～26 ℃，相對濕度為40%～70%，換氣次數大于15 次/h（GB 14925—2010《實驗動物 環境及設施》），晝夜明暗交替時間：12 h/12 h（7∶00～19∶00采用動物照明控制系統）。適應性飼養1 周后，將60 只成年雄性大鼠分成正常對照組（10 只）、模型組（50 只），正常對照組給予基礎飼料，模型組飼喂高脂飼料4 周進行造模。飼喂4 周后測定大鼠體質量和血清中總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）的濃度。大鼠造模成功后將模型組大鼠分為高脂模型組、陽性對照組（辛伐他汀）和火麻籽多肽低、中、高劑量組（800 mL/kgmb），每組10 只大鼠，且體質量無顯著差異，正常對照組飼喂基礎飼料，其他組飼喂高脂飼料，每日給陽性對照組灌胃10 mL/kgmb辛伐他汀，火麻籽多肽低、中、高劑量組分別灌胃200、400、800 mg/kgmb火麻籽多肽，繼續飼養4 周，每天灌胃1 次，灌胃容積為10 mL/kgmb，期間大鼠自由進食。實驗期間觀察大鼠的精神狀態、體態特征，每周固定時間稱量一次體質量、攝食量。實驗各劑量組給藥劑量參照[2012]107號（國食藥監保化）《輔助降血脂功能評價方法》設定。

1.3.3 指標測定

1.3.3 .1 全血黏度及血清指標的測定

對造模4 周的大鼠進行眼球內眥取血0.5 mL，3 000 r/min離心10 min，取上清液血清，采用全自動生化分析儀檢測各組大鼠血清中TC、TG、HDL-C和LDL-C的濃度。

飼喂8 周，大鼠末次灌胃后禁食12 h（不禁水），用質量分數10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，用肝素鈉采血管，腹主動脈取血，取血液4 mL，采用cobas c311全自動生化分析儀測定血漿黏度和全血低切黏度、全血中切黏度、全血高切黏度。用普通采血管將大鼠血液采凈，3 000 r/min離心10 min，取上清液血清，采用全自動生化分析儀檢測各組大鼠血清中TC、TG、HDL-C和LDL-C濃度，按ALT、AST檢測試劑盒說明書分別測定ALT、AST活力，按式（1）計算動脈硬化指數（atherosclerosis index，AI）[29]。

1.3.3 .2 臟器指數的測定

參考文獻[30]記錄大鼠處死前空腹體質量m0/g，大鼠處死后，解剖大鼠，迅速取出肝臟、心臟、腎臟和脾臟，用生理鹽水洗去表面的殘血，并用濾紙吸干，稱量臟器質量m/g。按式（2）計算大鼠的臟器指數。

1.3.3 .3 肝臟切片觀察

參照He Dongye等[7]的方法，將取出的肝臟固定在質量分數10%的中性緩沖福爾馬林固定液中，脫水后嵌入石蠟內，切成6 μm厚的薄片，經蘇木精-伊紅染色后至光學顯微鏡下進行病理組織觀察。

1.4 數據統計與分析

采用SPSS 17.0統計軟件處理，各項指標以平均值±標準差表示。多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05則表示有顯著性差異，P＜0.01表示有極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 火麻籽多肽干預前大鼠血脂指標

由表1可知，與正常對照組比較，高脂模型組大鼠的TG、TC、LDL-C水平極顯著升高（P＜0.01），HDL-C水平極顯著下降（P＜0.01），表明高血脂模型建模成功。

表1 火麻籽多肽干預前大鼠血脂指標（n=8）Table 1 Blood lipid indexes of rats before hemp seed peptide intervention (n= 8）

2.2 實驗期間大鼠的體質量、攝食量變化

體質量最能直觀反映大鼠是否發生病變[8]。由表2可知，大鼠的初始體質量基本一致，無顯著差異（P＞0.05），經過8 周的連續喂養，各組大鼠的體質量都有不同程度的增加，高脂模型組體質量顯著高于正常對照組（P＜0.05），說明飼喂高脂飼料能增加大鼠體質量。在同等飼喂條件下，陽性對照組和火麻籽多肽高劑量組最終體質量顯著低于高脂模型組（P＜0.05），火麻籽低、中劑量組與高脂模型組無顯著性差異（P＞0.05），說明火麻籽多肽干預時劑量越高，大鼠體質量增加越少，火麻籽多肽對高血脂大鼠體質量增加具有一定的抑制作用。火麻籽多肽干預期間，火麻籽多肽高、中、低劑量組大鼠的平均攝食量與模型對照組和陽性對照組相比無顯著差異。因此，推測火麻籽多肽對大鼠食欲無抑制作用。

表2 火麻籽多肽對大鼠體質量、攝食量的影響（n=8）Table 2 Effect of hemp seed peptide on body mass and food intake of rats (n= 8）

2.3 火麻籽多肽對大鼠臟器指數的影響

臟器指數可以反映各組大鼠營養情況和機體臟器的病變情況，當內臟受到外來物質損害時，臟器指數會上下浮動，超出正常值，臟器外觀、質量等會發生改變[31]。高血脂大鼠經過飼喂干預后，除肝臟外，其余器官無肉眼可見的病理性改變。正常對照組大鼠的肝臟鮮紅、光滑、邊緣清晰，高脂模型組與火麻籽多肽飼喂給藥組肝臟臟呈現白色，體積明顯增大。如表3所示，與正常對照組比較，高脂模型組肝臟指數極顯著增加（P＜0.01），其他臟器指數無顯著性變化（P＞0.05）。火麻籽多肽低、中劑量組及辛伐他汀組肝臟指數顯著低于高脂模型組（P＜0.05），火麻籽多肽高劑量組與高脂模型組的肝臟指數差異極顯著（P＜0.01），各組心臟指數、脾臟指數、腎臟指數之間均無顯著性差異（P＞0.05）。說明飼喂高脂飼料能造成肝臟脂肪堆積、增生、肥大，而對其他心臟、脾臟、腎臟的影響較小。

表3 火麻籽多肽對大鼠臟器指數的影響（n =8）Table 3 Visceral organ indexes of rats after hemp seed peptide intervention (n= 8)

2.4 火麻籽多肽對大鼠血清指標的影響

高脂血癥是血脂異常所致，其主要表現為血清中TC、TG和LDL-C水平過高或HDL-C水平過低[7]，是造成腦血栓的主要危險因素。血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C水平是評價動脈粥樣硬化的重要指標[32]，AI用于表示動脈硬化的危害性，衡量動脈硬化的程度及其心血管發病率[33]。由表4可知，大鼠高脂模型組與正常對照組比較，飼喂8 周后TG、TC、LDL-C水平及AI極顯著增加（P＜0.01），HDL-C水平極顯著下降（P＜0.01）。與高脂模型組比較，辛伐他汀組和火麻籽多肽中、高劑量組均能顯著降低TC、TG和LDL-C水平和AI（P＜0.05），顯著升高HDL-C水平（P＜0.05），火麻籽多肽低劑量組能夠顯著降低TC、TG和LDL-C水平（P＜0.05），但對HDL-C水平及AI影響無顯著性差異（P＞0.05）。結果表明火麻籽多肽在一定的范圍內，對大鼠高脂血癥及動脈硬化具有一定的預防作用。

表4 火麻籽多肽對大鼠血脂水平的影響（n=8）Table 4 Effect of hemp seed peptide on blood lipid levels of rats (n= 8)

2.5 火麻籽多肽對大鼠血清ALT、AST活力的影響

肝細胞被損害時ALT和AST會滲進血液，因此血清ALT和AST水平被作為評估肝細胞損傷的重要指標[34]，可評價肝臟的受損程度。由表5可知，與正常對照組比較，大鼠高脂模型組的ALT和AST水平顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。與高脂模型組比較，辛伐他汀組與火麻籽多肽中、高劑量組AST、ALT活力顯著降低（P＜0.05）；火麻籽多肽低劑量組AST活力顯著降低（P＜0.05），ALT活力無顯著性變化（P＞0.05）。結果表明，火麻籽多肽對大鼠肝臟具有一定的保護作用，能緩和高血脂對肝臟的傷害。

表5 火麻籽多肽對大鼠血清ALT、AST活力的影響（n =8）Table 5 Effect of hemp seed peptide on serum ALT and AST activities in rats (n= 8)

2.6 火麻籽多肽對大鼠全血黏度的影響

全血黏度是表征血液流變學的重要指標，黏度越高，流變性越差，越容易導致組織的局部缺血。采用cobas c311全自動生化分析儀檢測3 個不同切變速率（3、30、200 s－1）下的大鼠全血黏度、血漿黏度。如表6所示，高脂模型組在低、中、高切變速率下全血黏度及血漿黏度與正常對照組比較極顯著升高（P＜0.01）；與高脂模型組比較，辛伐他汀組及火麻籽多肽低、中、高劑量組在不同切變速率下的大鼠全血黏度及血漿黏度顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。

2.7 火麻籽多肽對大鼠肝組織病理變化的影響

如圖1所示，正常對照組大鼠肝組織中肝小葉結構清晰完整，肝竇清晰可見，肝細胞排列緊密，整齊有序且形態正常，胞漿內未出現脂肪空泡、無脂肪變性和脂肪壞死等現象。高脂模型組中肝小葉結構不清晰，細胞排列松散無序，有大量脂肪空泡的出現，肝細胞體積變大且部分壞死，中央靜脈附近的肝細胞排列紊亂，形態不完整，肝細胞損傷嚴重，呈現脂肪性肝病的組織病理學現象[35]。與高脂模型組相比，辛伐他汀組及火麻籽多肽低、中、高劑量組對肝小葉結構有不同程度的改善，肝細胞的脂肪變性程度降低，胞漿內的脂肪滴空泡減少，肝細胞排列整齊，其中火麻籽多肽中、高劑量組及辛伐他汀組改善效果最明顯，說明火麻籽多肽對大鼠脂肪肝變性程度具有改善作用。

圖1 火麻籽多肽對大鼠肝組織切片的影響（×400）Fig.1 Effect of hemp seed peptide on liver histomorphology in rats (× 400)

3 討 論

本研究通過飼喂高脂飼料，建立高脂血癥大鼠模型，分別灌胃陽性藥物和不同劑量的火麻籽多肽，8 周后，從大鼠的體質量、臟器、理化指標方面分析火麻籽多肽對高脂飲食喂養大鼠的影響，并通過大鼠的肝臟病理切片，觀察高脂飲食喂養大鼠的受損程度、陽性藥物及火麻籽多肽干預后，肝臟的改善情況。

高脂血癥是由脂蛋白代謝異常引起的慢性疾病，主要包括TC、TG、和LDL-C含量升高或HDL-C降低等，由于脂類物質的異常代謝使血脂異常升高而導致高脂血癥，而脂類物質的代謝是要受到生物體體內多種酶的調控，其中有一些酶在脂類代謝中發揮著關鍵作用或起到限制代謝反應速率的作用。

TC在肝臟中的3 條主要的代謝途徑為內源性TC合成、TC向膽汁酸的轉化以及低密度脂蛋白受體（low density lipoprotein receptor，LDL-R）對低密度脂蛋白的接受途徑[36]。3-羥基-3-甲基-戊二酸單酰輔酶A還原酶（3-hydroxy-3-methylglutharyl-coenzyme A reductase，HMGR）是膽固醇合成的限速酶，HMGR可以對膽固醇合成的前體物質——甲基二羥戊酸（methyldihydroxyvaleric acid，MVA）的形成起到催化作用，從而增加了體內膽固醇的合成[37]。高密度脂蛋白是一種抗動脈粥樣硬化的脂蛋白，可以將血液中過剩的膽固醇轉運至肝臟，是體內脂質的清道夫。卵磷脂膽固醇酰基轉移酶是參與膽固醇逆轉運過程的重要酶，它的主要功能是催化成熟的高密度脂蛋白將膽固醇以載脂蛋白的形式轉運回肝臟進一步代謝[38]。乙酰輔酶A乙酰基轉移酶2是催化游離膽固醇與脂蛋白結合生成膽固醇酯的關鍵酶，對于膽固醇在體內的儲存和吸收起到重要的調控作用[38]。乙酰輔酶A乙酰基轉移酶2主要在小腸和肝臟中表達，若其活性或基因的表達受到抑制會降低酯化膽固醇的生成，從而抑制膽固醇的吸收代謝。肝臟中的7α-羥化酶不僅可以促進膽固醇的代謝，同時對于膽固醇的逆向轉運也具有一定的促進作用。7α-羥化酶可以通過促進體內過多的膽固醇排出體外，從而起到了減少膽固醇在體內的積累[39]。血漿中低密度脂蛋白與內源性膽固醇結合形成LDL-C，LDL-C通過與LDL-R的結合被降解和轉化。LDL-R是肝臟細胞中LDL-C的受體，負責調控血液中LDL-C轉運至肝臟，從而清除血液中的LDL-C。因此，通過激活LDL-R，促進機體對LDL-C的降解，可以促進膽固醇的分解代謝。攝入體內的膽固醇必需以結合脂蛋白的形式才能進入代謝循環，而LDL-R是決定LDL-C能否被降解代謝的關鍵因子[40]。

TG是由脂肪酸和甘油結合形成的，脂肪酸合成以乙酰輔酶A為起始原料，乙酰輔酶A在一系列酶的作用下生成脂肪酸，脂肪酸與甘油合成TG，TG合成途徑中，脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，FAS）是關鍵酶，如果FAS基因表達量升高，脂肪酸的合成量就會增加，甘油三酯合成量也隨之增加。可通過抑制脂肪酸合成通路中FAS的表達水平而抑制脂肪酸的合成，最終降低血清TG水平[41]。與高脂模型組相比，火麻籽多肽中、高劑量組均能顯著降低血清中TC、TG、LDL-C水平和AI（P＜0.05），顯著升高HDL-C水平（P＜0.05），可能原因是火麻籽多肽激活了TC、TG代謝通路的關鍵酶，進一步調節血脂代謝以達到降血脂作用。

高脂飲食可引起血脂異常，導致肝臟脂代謝紊亂，脂肪在肝臟過度堆積，出現非酒精性脂肪肝、脂肪性肝炎甚至肝硬化，其中脂質代謝紊亂是肝臟損傷的一個重要因素[42]。肝臟具有去氧化、儲存肝糖原等作用，是人和動物體內的代謝中心，能參與體內的多個生理過程。肝臟中含有大量的AST與ALT，在正常狀態下，AST和ALT只存在于細胞內，當細胞膜受到刺激時AST和ALT被釋放到胞外，會導致血液中AST和ALT活力升高[43]。TG蓄積會導致脂質代謝障礙，加重肝損傷程度，故臨床上一般通過測定血清中AST、ALT活力和肝臟中TG活力來判斷肝損傷程度[44]。本研究通過測定高脂飲食喂養大鼠血清中ALT和AST的活力，分析火麻籽多肽對高脂飲食喂養大鼠的肝臟是否有保護作用。根據數據分析可知，與高脂模型組比較，陽性藥物及中、高劑量的火麻籽多肽能顯著降低ALT和AST活力（P＜0.05），低劑量的火麻籽多肽能顯著降低AST水平（P＜0.05），但對ALT水平無顯著影響（P＞0.05），可能的原因是低劑量的火麻籽多肽對高脂飲食喂養大鼠肝臟的保護作用較小，使血清中ALT水平降低不明顯。通過肝臟組織病理切片觀察，火麻籽多肽低、中、高劑量對肝小葉結構、肝臟脂肪變性程度有不同程度的改善，這一結果與火麻籽多肽改善肝臟中AST與ALT活力相一致，說明在一定范圍內，火麻籽多肽對肝臟具有保護作用。

綜上所述，火麻籽多肽能夠調節喂食高脂飼料致大鼠高脂血癥模型的血脂水平，減輕肝臟脂肪變性程度，有望成為安全有效的抗高脂血癥保健食品，本研究為漢麻籽多肽的開發利用提供了理論依據。