基于代謝組學研究繡球菌多糖對高脂血癥大鼠的降血脂作用

高 淵，楊亞茹，常明昌,2，孟俊龍,2，劉靖宇,2，馮翠萍,

（1.山西農業大學食品科學與工程學院，山西 太谷 030801；2.山西省食用菌工程技術研究中心，山西 太谷 030801）

長期攝入高脂高膽固醇類食物會導致人體脂代謝紊亂，從而誘發肥胖、高脂血癥等慢性代謝疾病，危害人體健康。多糖被認為能夠很好地預防和控制這類疾病。研究發現天然多糖可以通過調節一系列信號通路降低甘油三酯和膽固醇水平[1]。Gu Wen等[2]研究發現黃精多糖能夠緩解炎癥，預防糖脂代謝紊亂。Ma Ming等[3]研究表明枸杞多糖能夠明顯抑制脂質過氧化，從而預防心腦血管疾病的發生。楊波等[4]研究發現五味子、黃芪混合多糖能夠促進肝臟膽固醇代謝，對高脂血癥大鼠具有降脂作用。Li Yuxin等[5]研究發現姬松茸酸性多糖具有降脂活性，其降脂機制是通過激活相關的膽固醇代謝途徑。

目前，已有大量研究表明食用菌多糖具有廣泛的生物活性[6]。繡球菌（Sparassis crispa）是一種珍貴的食藥用菌[7]，其子實體含有多種活性物質[8]，多糖質量分數可達39.3%～43.6%[9-10]。研究表明，繡球菌多糖具有抗炎癥[11-12]、抗氧化[13]、抗腫瘤[14]、抗衰老[15]、提高免疫力[16]、抑菌[17]等多種功效。

代謝組學是連接基因型和表型的橋梁，其研究對象主要是生物有機體內的小分子內源性代謝物（分子質量小于1 000 Da）[18]。代謝組學技術可以從整體和動態的角度揭示外源刺激或干擾對生命系統代謝反應的影響[19]。目前，有關繡球菌多糖功能作用的研究大多集中在抗氧化、抗腫瘤及免疫調節等方面，對其降血脂的功能研究較少。因此本實驗主要研究繡球菌多糖對高脂血癥模型大鼠血脂水平的影響，采用氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術檢測血清中代謝物的變化，并從代謝組學角度分析其中潛在的差異代謝物及相關代謝通路，從而探究繡球菌多糖降血脂的功效及作用機理。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

6 周齡SPF級雌性SD大鼠，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證號：SCXK（京）2016-0006。

繡球菌子實體 山西太和食用菌栽培基地；豬膽鹽北京索萊寶科技有限公司；膽固醇、甲氧胺鹽酸鹽和N,O-雙(三甲基硅)三氟乙酰胺 上海阿拉丁生物科技有限公司；總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglycerides，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（lowdensity lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、總膽汁酸（total bile acid，TBA）試劑盒 南京建成生物工程研究所；大鼠谷氨酸、谷氨酰胺酶聯免疫分析試劑盒 上海將來實業股份有限公司；吡啶、甲醇、正庚烷均為色譜純；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

D-375高速冷凍離心機 德國Sigma公司；N-EVAP-111氮吹儀 美國Organomation公司；Spectra Max i3x多功能酶標儀 美國Molecular Devices公司；WFJ2100可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；Trace ISQ GC-MC儀 美國ThermoFisher公司。

1.3 方法

1.3.1 繡球菌多糖制備

參考文獻[20]，將繡球菌子實體置于35 ℃烘箱中干燥，切片粉碎過200 目篩，取繡球菌子實體粉，按料液比1∶40（m/V）加入蒸餾水，75 ℃浸提3 h。使用旋轉蒸發儀80 ℃濃縮提取液至黏稠狀，加入3 倍體積的無水乙醇沉淀，混勻，置于4 ℃冰箱12 h，離心收集沉淀，分別用丙酮、乙醚洗滌沉淀至洗液澄清。參考文獻[21]使用Sevag法除蛋白，參考文獻[22]使用HZ-830大孔樹脂純化后真空冷凍干燥，得到繡球菌多糖，經苯酚-硫酸法[23]測得多糖純度為85.7%。

1.3.2 動物分組及設計

50 只6 周齡SPF級雌性SD大鼠適應性喂養1 周后，按體質量隨機分為5 組：正常對照組（NC組），高脂血癥模型組（HFCM組），繡球菌多糖低（HFC+LD）、中（HFC+MD）和高（HFC+HD）劑量組，每組10 只，各組大鼠體質量差異無統計學意義。對照組飼喂基礎飼料，其余4 組飼喂高脂高膽固醇飼料。每日給繡球菌多糖低、中、高劑量組分別灌胃100、200、400 mg/kgmb繡球菌多糖，其余2 組灌胃等質量的生理鹽水，期間自由飲水進食。高脂高膽固醇飼料配方為：基礎飼料88.8%（質量分數，后同）、豬油10%、膽固醇1%、膽鹽0.2%。

1.3.3 樣本采集及保存

5 組大鼠飼喂8 周后，禁食12 h，用乙醚麻醉，眼球取血并于4 ℃、4 000 r/min條件下離心15 min。分離血清后置于－80 ℃冰箱中保存，用于血清生化指標和差異代謝物的測定。

1.3.4 血清脂質指標測定

按照試劑盒說明書測定TC、TG、LDL-C、HDL-C、TBA濃度。

1.3.5 血清代謝物的GC-MS檢測

參考文獻[24-25]進行血清預處理。血清解凍后取100 μL加入600 μL甲醇，漩渦振蕩1 min，冰水浴超聲提取10 min并于4 ℃、12 000 r/min的條件下離心15 min；取400 μL上清液轉移到玻璃管中，氮氣吹干，加入15 μg/μL甲氧胺吡啶溶液75 μL，漩渦5 min，70 ℃水浴肟化1 h，再加入75 μLN,O-雙(三甲基硅)三氟乙酰胺，漩渦5 min，室溫下放置1 h；加入200 μL正庚烷，漩渦30 s，4 000 r/min離心10 min，取200 μL上清液置于樣品瓶中進行GC-MS檢測。

GC條件：VF-5MS熔融石英毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫條件：起始溫度70 ℃，以10 ℃/min的速率均勻升至180 ℃，保持3 min，再以20 ℃/min的速率均勻升至260 ℃；載氣（氦氣）流速1 mL/min；進樣量1 μL；分流比20∶1。

MS條件：電離電壓70 eV；檢測電壓0.9 kV；電子轟擊離子源溫度280 ℃；接口溫度280 ℃；進樣口溫度240 ℃；掃描模式：全掃描；質量范圍m/z45～450，掃描間隔0.2 s。

1.3.6 血清樣品中谷氨酸、谷氨酰胺濃度的測定

采用相應酶聯免疫分析試劑盒測定血清樣品中谷氨酸、谷氨酰胺濃度。

1.4 數據處理及分析

血清脂質指標相關數據使用SPSS 23.0進行統計學分析，采用單因素方差分析下的Duncan檢驗進行多組樣本間的差異顯著性分析，P＜0.05表示差異具有顯著性。結果以平均值±標準差表示，并用Graphpad prism 8.0作圖。

GC-MS采集的數據經過Thermo Xcalibur軟件和NIST 08標準譜庫進行峰的提取和匹配，然后進行峰面積歸一化處理，導入SIMCA 14.1軟件中進行主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least square-discriminate analysis，OPLS-DA），并使用Metabo Analyst 4.0平臺對差異代謝物進行差異代謝物篩選、聚類分析及通路分析。

2 結果與分析

2.1 繡球菌多糖對大鼠血清脂質指標的影響

各組大鼠血清脂質指標的檢測結果如圖1所示。與正常對照組比較，高脂血癥模型組大鼠血清中TC、LDL-C、TBA濃度顯著升高（P＜0.05）；高脂血癥模型組大鼠血清中TG濃度高于正常對照組，差異不顯著（P＞0.05）；高脂血癥模型組大鼠血清中的HDL-C濃度顯著低于正常對照組（P＜0.05）。與高脂血癥模型組比較，繡球菌多糖干預組大鼠血清中的TC、TG、LDL-C、TBA濃度降低，其中繡球菌多糖高劑量組的TC濃度顯著降低（P＜0.05）；HDL-C濃度有升高趨勢，但變化不顯著（P＞0.05）。

圖1 繡球菌多糖對大鼠血清脂質指標的影響（n＝ 10）Fig.1 Effects of Sparassis crispa polysaccharides on serum lipid indexes in rats (n = 10)

2.2 繡球菌多糖對大鼠血清代謝物的影響

2.2.1 血清代謝物定性分析結果

血清樣本預處理后進行GC-MS檢測，選取正常對照組、高脂血癥模型組、繡球菌多糖高劑量組的大鼠血清樣本GC-MS數據進行分析（圖2）。對比發現這3 組血清代謝譜的峰高和峰面積均有差異，說明有差異代謝物的存在。

圖2 NC（A）、HFCM（B）、HFC＋HD（C）組血清代謝物的GC-MS總離子流色譜圖Fig.2 GC-MS total ion current chromatograms of serum metabolites in NC (A), HFCM (B), and HFC + HD (C) groups

2.2.2 血清代謝物的主成分分析和正交偏最小二乘-判別分析結果

對正常對照、高脂血癥模型、繡球菌多糖高劑量組血清樣本GC-MS數據進行主成分分析（n＝8），結果如圖3所示。正常對照組與高脂血癥模型組樣本不能被顯著區分（圖3A），高脂血癥模型組與繡球菌多糖高劑量組樣本可以被顯著區分（圖3B），且沒有離群樣本。進一步進行OPLS-DA（圖4），其橫坐標為預測主成分得分，縱坐標為正交主成分得分。圖4A中，（模型對X變量的解釋度）＝0.978，（模型對Y變量的解釋度）＝0.986，Q2（模型的可預測度）＝0.384；圖4B中，＝0.978，＝0.997，Q2＝0.972，可以看出正常對照組與高脂血癥模型組、高劑量組與高脂血癥模型組樣本均能夠被明顯分開，說明正常對照組與高脂血癥模型組、繡球菌多糖高劑量組與高脂血癥模型組的代謝信息有明顯差異。

圖3 NC組與HFCM組（A）、HFCM組與HFC＋HD組（B）血清代謝物的PCA得分圖Fig.3 Principal component analysis score plots of serum metabolites in NC and HFCM (A), HFCM and HFC + HD (B) groups

圖4 NC組與HFCM組（A）、HFCM組與HFC＋HD組（B）血清代謝物的OPLS-DA得分圖Fig.4 Orthogonal partial least square-discriminate analysis score pots of serum metabolites in NC and HFCM (A), HFCM and HFC + HD (B) groups

2.2.3 差異代謝物篩選結果

通過OPLS-DA模型對各組進行分析后可以得到S-Plot載荷圖（圖5）和變量重要性（variable importance in the projection，VIP）圖（圖6）。在S-Plot圖中，橫坐標為每個代謝物對模型分組的影響大小，縱坐標解釋了每個代謝物對模型分組的可靠性，每一個點代表一個代謝物，顯示兩組之間差異的內源性分子，代謝物對組間差異的貢獻由VIP值衡量，變量離原點越遠，VIP值越大。VIP圖能夠以降序的形式顯示各變量的重要程度，其橫坐標為每個變量的名稱，縱坐標為VIP值，根據VIP值對變量進行篩選，選擇VIP＞1.2且相對峰面積獨立樣本t檢驗P＜0.05的物質作為潛在的差異代謝物。從正常對照組和高脂血癥模型組血清中篩選出11 種差異代謝物（表1）。與正常對照組相比，高脂血癥模型組血清中代謝物表達上調的主要有苯丙氨酸、蛋氨酸、丙酸與纈氨酸；下調的主要有1,5-脫水山梨糖醇、丙氨酸、絲氨酸、甘氨酸、脯氨酸、谷氨酸和蘇氨酸。從高脂血癥模型組和繡球菌多糖高劑量組血清中篩選出14 種差異代謝物（表2）。與高脂血癥模型組相比，繡球菌多糖高劑量組血清中代謝物表達上調的主要有戊酸、酪氨酸、甘油、甘氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、丙氨酸和琥珀酸；下調的代謝物主要有尿素、嘧啶、葡萄糖、膽固醇、異亮氨酸和棕櫚酸。

圖5 NC組與HFCM組（A）、HFCM組與HFC＋HD組（B）血清代謝物的S-Plot圖Fig.5 S-Plot of serum metabolites in NC group versus HFCM group (A),and HFCM group versus HFC + HD group (B)

表2 HFCM組和HFC＋HD組血清中主要差異代謝物Table 2 Main differential serum metabolites in HFCM and HFC + HD groups

圖6 NC組與HFCM組（A）、HFCM組與HFC＋HD組（B）血清代謝物的VIP圖Fig.6 Variable importance in the projection map of serum metabolites in NC versus HFCM groups (A), and HFCM versus HFC + HD (B) groups

表1 NC組和HFCM組血清中主要差異代謝物Table 1 Main differential serum metabolites in NC and HFCM groups

2.2.4 差異代謝物聚類分析與通路分析結果

聚類分析圖可以反映出差異代謝物在各組相對含量增加或減少的情況（圖7）。與正常對照組相比，高脂血癥模型組差異代謝物相對含量與對照組相比發生較大改變，而高劑量繡球菌多糖的干預能夠抑制這種改變。

圖7 NC、HFCM、HFC＋HD組血清中差異代謝物的聚類分析Fig.7 Cluster analysis of different serum metabolites in NC, HFCM and HFC + HD groups

對正常對照組和高脂血癥模型組、高脂血癥模型組和高劑量組之間的差異代謝物進行代謝通路分析（圖8），并采用HMDB數據庫進行對比。將差異代謝物對通路的影響值大于0.2的代謝通路作為潛在的靶標代謝通路，共發現8 條相關的代謝通路，除了共有的纈氨酸、亮氨酸與異亮氨酸合成，甘氨酸、絲氨酸與蘇氨酸合成，苯丙氨酸、酪氨酸與色氨酸合成，丙氨酸、天冬氨酸與谷氨酸代謝，甲烷代謝，花生四烯酸代謝和甘油磷脂代謝之外，高脂血癥模型組和繡球菌多糖高劑量組之間還涉及谷氨酸與谷氨酰胺代謝，繡球菌多糖可能通過影響這些代謝通路來改善高脂血癥大鼠血脂的異常，其中谷氨酸與谷氨酰胺代謝的影響最大。

圖8 NC組與HFCM組（A）、HFCM組與HFC＋HD組（B）血清中差異代謝物的代謝通路分析Fig.8 Analysis of metabolic pathways of differential serum metabolites between NC and HFCM groups (A), and between HFCM and HFC + HD groups (B)

2.3 繡球菌多糖對大鼠血清谷氨酸和谷氨酰胺水平的影響

對大鼠血清的谷氨酸和谷氨酰胺水平進行測定，結果見圖9。與正常對照組比較，高脂血癥模型組的谷氨酸和谷氨酰胺水平降低，其中谷氨酸水平顯著降低（P＜0.05）；與高脂血癥模型組比較，繡球菌多糖干預組血清中谷氨酸和谷氨酰胺水平有升高趨勢，其中低劑量組中谷氨酸水平顯著高于高脂血癥模型組（P＜0.05），中、高劑量組大鼠血清中的谷氨酸、谷氨酰胺水平顯著高于高脂血癥模型組（P＜0.05）。

圖9 繡球菌多糖對大鼠血清谷氨酸（A）和谷氨酰胺（B）水平的影響（n＝10）Fig.9 Effect of Sparassis crispa polysaccharides on serum glutamic acid (A) and glutamine (B) in rats (n = 10)

3 討 論

許多食藥用菌的有效成分可以通過調控機體膽固醇代謝和甘油三酯代謝達到降血脂的功效[26]。本實驗發現繡球菌多糖能夠顯著降低高脂血癥大鼠血清的TC濃度，從而達到降血脂的功效。根據進一步對大鼠血清的代謝組學分析，并得到OPLS-DA評分圖，可以發現高脂血癥模型組和繡球菌多糖高劑量組的樣本可以完全被區分，說明繡球菌多糖的干預對高脂血癥大鼠有明顯的影響。通過VIP圖篩選和代謝通路分析，發現繡球菌多糖的降血脂作用主要與機體內的氨基酸代謝和脂質代謝有關。

繡球菌多糖能夠通過調節血清中的氨基酸來改善血脂異常。與NC組相比，高脂血癥模型組大鼠血清中苯丙氨酸、蛋氨酸和纈氨酸水平上升，谷氨酸、脯氨酸水平下降；與高脂血癥模型組相比，繡球菌多糖高劑量組大鼠血清中異亮氨酸水平降低，酪氨酸、絲氨酸水平升高。Teymoori等[27]研究結果也表明，一些氨基酸水平的變化能夠增加或減少血脂水平，其中蛋氨酸、纈氨酸和異亮氨酸的增加會導致TG水平升高，而谷氨酸的增加會導致TG、TC水平的降低。本實驗通過測定血清中谷氨酸和谷氨酰胺的水平發現繡球菌多糖能夠顯著調節血清中谷氨酸和谷氨酰胺水平，谷氨酸水平的上升可以使其被谷氨酰胺合成酶催化為谷氨酰胺，從而對機體脂質代謝產生重要作用。Petrus等[28]研究發現，谷氨酰胺可以緩解小鼠脂肪組織的炎癥，且其水平與脂肪量呈負相關。苯丙氨酸可以被苯丙氨酸羥化酶催化為酪氨酸，使酪氨酸水平升高，進而影響機體的糖脂代謝[29]。本研究發現，繡球菌多糖誘導酪氨酸、脯氨酸和絲氨酸濃度上升，并可減輕血脂異常，這與Okekunle等[30]的研究結果相似，其發現這3 種氨基酸的攝入量與肥胖風險呈負相關。

與高脂血癥模型組相比，繡球菌多糖組可使大鼠血清中甘油、琥珀酸水平升高，膽固醇、棕櫚酸水平下降。機體攝入的TG可分解為甘油和脂肪酸，甘油水平的上升說明繡球菌多糖能夠促進TG分解；膽固醇水平的下降說明繡球菌多糖能夠促進膽固醇轉運到肝臟進行代謝。Takeyama等[31]也同樣發現膳食繡球菌能夠顯著降低甘油三酯和膽固醇濃度，從而表現出抗肥胖和抗高脂血癥活性。琥珀酸是三羧酸循環的中間產物，其濃度的上升能夠增加琥珀酸脫氫酶的活性，從而上調活性氧濃度，最終促進棕色脂肪分解[32]。棕櫚酸是機體中飽和脂肪酸的主要來源，其濃度的上升會誘導動脈粥樣硬化的發展[33]。

綜上所述，繡球菌多糖可調節高脂血癥大鼠血清中的氨基酸和脂類物質，提高有益代謝物水平，從而改善機體內血脂異常的狀態。

4 結 論

本實驗采用基于GC-MS的代謝組學技術研究繡球菌多糖對高脂血癥大鼠血清代謝產物的干預情況，通過多元統計分析，發現高脂高膽固醇飼料會引起大鼠血清中代謝物的明顯改變，其中篩選出的顯著差異代謝物主要為氨基酸類物質，說明高脂血癥模型組大鼠體內可能存在氨基酸代謝異常，進而導致脂質代謝的紊亂。與高脂血癥模型組相比，高劑量繡球菌多糖干預8 周后可以顯著回調部分氨基酸水平（P＜0.05），并降低葡萄糖和膽固醇水平，提示繡球菌多糖對大鼠體內的氨基酸和脂質代謝紊亂有改善作用。進一步的代謝通路分析發現谷氨酸與谷氨酰胺代謝對繡球菌多糖的干預作用影響最大，通過對血清中谷氨酸和谷氨酰胺水平的測定，發現與高脂血癥模型組相比，中、高劑量繡球菌多糖能夠顯著調節其水平（P＜0.05），證明繡球菌多糖可能通過調節谷氨酸與谷氨酰胺代謝起到降血脂的作用。