小檗堿調(diào)節(jié)AKT/NF-κB信號(hào)通路對(duì)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷、凋亡和遷移的影響

汪佳佳，胡亞琴，吳 昊，唐麗琴,2，魏 偉

糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病的微血管并發(fā)癥之一。DN的發(fā)生與炎癥因子釋放、脂糖代謝紊亂、氧化應(yīng)激等因素相關(guān)。足細(xì)胞是腎小球的主要組成部分，可維持腎小球的濾過功能。足細(xì)胞損傷、凋亡和異常遷移是DN發(fā)展早期的一個(gè)重要標(biāo)志，深入研究其損傷機(jī)制是研究DN發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)的激活與細(xì)胞凋亡、炎癥免疫等密切相關(guān)，蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)受環(huán)境刺激磷酸化時(shí)，可促進(jìn)NF-κB p65的磷酸化入核、核因子抑制蛋白α(inhibitor of NF-κB α，IκBα)激酶活化、炎癥反應(yīng)的發(fā)生、細(xì)胞促凋亡蛋白(Bcl-2 interacting mediator of cell death，Bim)異常上升。AKT/NF-κB信號(hào)通路的激活可導(dǎo)致足細(xì)胞損傷，加重腎臟病變。小檗堿(berberine，BBR)又名黃連素，其藥理作用廣泛，包括降血糖、降血脂和抗炎等，對(duì)糖尿病具有一定的治療作用。研究表明BBR能夠緩解DN的足細(xì)胞損傷。該文研究了BBR對(duì)足細(xì)胞的保護(hù)作用及其與AKT/NF-κB信號(hào)通路的關(guān)系，為臨床上對(duì)DN的防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

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細(xì)胞株 小鼠腎小球足細(xì)胞株(貨號(hào)：BNCC 337685)購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所建系。

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藥物 BBR(貨號(hào)：BW 50137)購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究所，經(jīng)高效液相色譜法檢測(cè)其純度為98.37%。精密稱取BBR粉末55.08 g ，加入1.820 ml 0.9%氯化鈉溶液混勻，加熱、渦旋至完全溶解，配制成濃度為9×10μmol/L的BBR 儲(chǔ)備液，0.22 μm無菌過濾器過濾后于冰箱-20 ℃保存。使用前加熱溶解，稀釋到所需濃度即可用于實(shí)驗(yàn)。

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試劑 Annexin FITC/PI apoptosis kit細(xì)胞凋亡試劑盒(貨號(hào)：AP101-100-kit)購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；StarSignal化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：E171-01)購自上海康朗生物科技有限公司；RPMI 1640液體培養(yǎng)基(貨號(hào)：SH30809.1)購自上海江林生物科技有限公司；抗AKT抗體(貨號(hào)：4691S)、抗p-AKT抗體(貨號(hào)：4060S)、抗p-p65抗體(貨號(hào)：3033S)、抗p65抗體(貨號(hào)：8242S)、抗p-IκBα抗體(貨號(hào)：2859S)、抗IκBα抗體(貨號(hào)：9242S)、抗Bim抗體(貨號(hào)：2933)購自美國Cell Signaling Technology公司；抗足細(xì)胞抑癌基因(Wilm′s tumor gene-1，WT-1)抗體(貨號(hào)：sc-192)、抗腎小球足細(xì)胞裂隙膜蛋白(podocyte slid membrane protein，Podocin)抗體(貨號(hào)：sc-21009)購自美國Santa Cruz Biotechnology公司。

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儀器 OLYMPUS CKX31型倒置顯微鏡為日本奧林巴斯有限公司產(chǎn)品；Image Xpress Micro4型高內(nèi)涵細(xì)胞成像系統(tǒng)為美國Molecular Devecies公司產(chǎn)品；FC500型貝克曼流式細(xì)胞儀為美國貝克曼庫爾特公司產(chǎn)品；Image Quant Las 4000 mini型化學(xué)發(fā)光成像分析儀為美國GEHealthcare Life Sciences公司產(chǎn)品。

1.2 方法

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細(xì)胞培養(yǎng) 取出-80 ℃冰箱或液氮中冷凍保存的細(xì)胞，于37 ℃水浴鍋中解凍融化后離心，用配制好的細(xì)胞培養(yǎng)基(RPMI 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基+ 10%血清+ 1%雙抗+ 0.2%γ-干擾素)重懸后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶，于5% CO、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

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2

Annexin FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取6孔板，每孔加入1×10個(gè)/ml足細(xì)胞的單細(xì)胞懸液2 ml，貼壁后將其設(shè)為五組，分別為正常組(葡萄糖濃度為11.1 mmol/L)、高糖組(葡萄糖濃度為30 mmol/L)和不同濃度BBR給藥組(BBR 30、60、90 μmol/L組)，按組分別加糖或給藥后培養(yǎng)24 h，不含EDTA的胰酶消化離心，收集細(xì)胞后，采用Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，于流式細(xì)胞儀上檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。

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3

高內(nèi)涵細(xì)胞成像系統(tǒng)檢測(cè)細(xì)胞增殖 取96孔板，將足細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后每孔種 3×10個(gè)/ml的細(xì)胞懸液100 μl，待細(xì)胞貼壁后分組加糖或給藥，24 h后棄去上清液，預(yù)冷PBS洗去死細(xì)胞，經(jīng)過4%多聚甲醛固定、DAPI染核等步驟后上機(jī)，高內(nèi)涵細(xì)胞成像系統(tǒng)計(jì)算各組足細(xì)胞數(shù)量。

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4

細(xì)胞遷移(Transwell)實(shí)驗(yàn) 取出24孔板中的小室，下室分別加入500 μl的含15% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，分組和加藥同1.2.2，再將Transwell小室放入對(duì)應(yīng)的孔中，上室每孔接種含5% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基、1×10個(gè)/ml的單個(gè)足細(xì)胞懸液200 μl，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后取出小室，放入含0.1%結(jié)晶紫的0.9%氯化鈉溶液中染色，0.9%氯化鈉溶液清洗2次，仔細(xì)擦去黏附于小室內(nèi)壁的細(xì)胞，使用倒置顯微鏡觀察結(jié)果并拍攝留存。隨機(jī)選取5個(gè)視野，分別計(jì)算細(xì)胞數(shù)。

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5

細(xì)胞遷移(劃痕)實(shí)驗(yàn) 在6孔板背面水平劃出6條平行的直線(每孔均勻地穿過兩條直線)，將細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)至孔板的80%以上時(shí)在孔中均勻地劃出與背面直線垂直的兩條直線，PBS洗去死細(xì)胞后，分別刺激和給藥同1.2.2，于0、24 h在顯微鏡下觀察、拍照并計(jì)算劃痕的面積。

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Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)水平 將足細(xì)胞消化制備成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，以每孔約1×10個(gè)細(xì)胞種于6孔板，分組及加藥同1.2.2，培養(yǎng)24 h后，用PBS洗去死細(xì)胞及雜質(zhì)，將150 μl含1% PMSF和1%磷酸酶抑制劑的RIPA細(xì)胞裂解液加入孔板中，4 ℃裂解30 min，收集于1.5 ml EP管并離心，所提取的蛋白在上清液中，加入蛋白上樣緩沖溶液煮沸后得到蛋白樣本，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，分別孵育AKT、p-AKT、p65、p-p65、IκBα、p-IκBα、Bim、WT-1、Podocin、足細(xì)胞結(jié)蛋白(podocyte desmin，desmin)對(duì)應(yīng)抗體，最后用化學(xué)發(fā)光成像分析儀進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 BBR對(duì)足細(xì)胞凋亡的影響

與正常組相比，高糖組足細(xì)胞凋亡率上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=57.850，

P

<0.01)；與高糖組相比，BBR 30、60、90 μmol/L給藥組能使足細(xì)胞的凋亡率下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=75.594，

P

<0.05)，且隨著BBR濃度的增大，其降低凋亡率的能力也逐漸上升。見圖1。

圖1 BBR對(duì)足細(xì)胞凋亡率的影響

2.2 BBR對(duì)足細(xì)胞增殖數(shù)量的影響

與正常組相比，高糖組足細(xì)胞數(shù)量減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=267.701，

P

<0.01)；與高糖組相比，BBR 30、60、90 μmol/L組足細(xì)胞數(shù)量逐漸增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=349.779，

P

<0.01)。見圖2。

圖2 BBR對(duì)足細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

2.3 BBR對(duì)足細(xì)胞遷移能力的影響

與正常組相比，高糖組遷移至下室的足細(xì)胞增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=116.326，

P

<0.01)；BBR 30、60、90 μmol/L組遷移至下室的細(xì)胞數(shù)逐漸下降，與高糖組相比，BBR給藥組遷移至下室的細(xì)胞數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=153.166，

P

<0.05)。見圖3A。與正常組相比，高糖組劃痕愈合率有所增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=177.807，

P

<0.01)；BBR 30、60、90 μmol/L組劃痕愈合率逐漸降低，與高糖組相比，BBR給藥組劃痕愈合率降低，異常遷移的足細(xì)胞數(shù)有所減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=231.058，

P

<0.01)。見圖3B。

圖3 BBR對(duì)足細(xì)胞遷移能力的影響

2.4 BBR對(duì)高糖刺激后的足細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，與正常組相比，高糖組足細(xì)胞中的 AKT、p65、IκBα磷酸化水平升高，Bim蛋白表達(dá)上升， p-AKT/AKT、p-p65/p-65、 p-IκBα/IκBα、Bim/β-actin上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=13.978、17.776、14.283、120.821，

P

<0.01)；與高糖組相比，不同濃度BBR給藥組AKT、p65、IκBα磷酸化水平降低，Bim蛋白表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=14.971、23.701、15.500、82.618，

P

<0.05)。見圖4。

圖4 Western blot 檢測(cè)p-AKT/AKT、p-p65/p-65、p-IκBα/IκBα and Bim/β-actin蛋白表達(dá)

2.5 BBR對(duì)足細(xì)胞標(biāo)志性蛋白的影響

與正常組相比，高糖組足細(xì)胞中的 WT-1、Podocin蛋白表達(dá)下降，desmin蛋白表達(dá)上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=123.743、21.447、172.166，

P

<0.01)；與高糖組相比，不同濃度BBR給藥組WT-1、Podocin蛋白表達(dá)上升，desmin蛋白表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=164.146、18.717、210.587，

P

<0.01)。見圖5。

圖5 Western blot檢測(cè)desmin、WT-1、Podocin蛋白表達(dá)

3 討論

足細(xì)胞是腎小球的主要組成部分，它與腎小球基底膜、內(nèi)皮細(xì)胞共同構(gòu)成了腎小球的濾過屏障，保證了腎小球的濾過功能。而高血糖環(huán)境會(huì)導(dǎo)致足細(xì)胞損傷、足突融合消退，足細(xì)胞異常遷移、從基底膜上脫落。足細(xì)胞的損傷、丟失又能進(jìn)一步加重腎臟的病變。本研究是以足細(xì)胞為研究對(duì)象，高糖組的建立是借助于30 mmol/L的葡萄糖刺激24 h產(chǎn)生，該方法的可行性已有研究證實(shí)。本次研究結(jié)果顯示，相比于高糖組，不同濃度的BBR給藥組能夠降低足細(xì)胞凋亡率，增強(qiáng)足細(xì)胞增殖能力，緩解足細(xì)胞異常遷移。說明BBR給藥能有效抑制高糖刺激下的足細(xì)胞凋亡、減弱足細(xì)胞遷移能力、改善足細(xì)胞功能異常。劉青 等研究表明不同濃度(30、60、90 μmol/L)的BBR給藥能不同程度地發(fā)揮足細(xì)胞保護(hù)作用，與本次實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果一致，且為本次實(shí)驗(yàn)BBR的濃度選擇提供了理論依據(jù)。

Podocin、WT-1 和desmin都屬于足細(xì)胞標(biāo)志蛋白，Podocin 和 WT-1是細(xì)胞骨架的重要分子結(jié)構(gòu)，在足細(xì)胞損傷時(shí)會(huì)發(fā)生缺失。而 desmin 是細(xì)胞骨架的中間絲蛋白，正常條件下不表達(dá)或低表達(dá)，但在足細(xì)胞功能受損時(shí)大量表達(dá)。本次研究結(jié)果顯示，相比于模型組，BBR給藥組能夠升高Podocin、WT-1蛋白的表達(dá)，降低desmin蛋白的表達(dá)，說明BBR給藥能夠改善足細(xì)胞標(biāo)志性蛋白的異常表達(dá)，緩解足細(xì)胞損傷。NF-κB家族有5個(gè)成員：RelA(p65)、RelB、c-Rel、p50和p52。正常情況下，NF-κB二聚體通過協(xié)同IκB定位于細(xì)胞質(zhì)中，其包括3種經(jīng)典的蛋白IκBα、 IκBβ和IκBε。當(dāng)IκBα被免疫蛋白酶降解時(shí)會(huì)釋放活化的p65，并促使其向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)化，有研究表明AKT的磷酸化會(huì)促進(jìn)NF-κB信號(hào)通路的激活，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Bim是一種細(xì)胞凋亡蛋白，會(huì)在凋亡的細(xì)胞中大量表達(dá)，激活NF-κB信號(hào)通路促細(xì)胞凋亡的同時(shí)Bim蛋白異常上升。本研究顯示，相比于模型組，BBR給藥組能有效降低高糖刺激下AKT、p65、IκBα的磷酸化水平，同時(shí)降低細(xì)胞凋亡蛋白Bim的表達(dá)水平，說明BBR可能通過AKT/NF-κB信號(hào)通路改善足細(xì)胞凋亡。Wang et al研究表明NF-κB信號(hào)通路與足細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，與本次研究結(jié)果一致。

綜上所述，高糖刺激可以通過調(diào)節(jié)AKT/NF-κB信號(hào)通路下調(diào)異常表達(dá)的Bim蛋白，從而抑制足細(xì)胞凋亡、改善足細(xì)胞損傷、減弱足細(xì)胞遷移能力以發(fā)揮足細(xì)胞保護(hù)作用。