AKT/mTOR信號(hào)通路介導(dǎo)神經(jīng)病理性疼痛對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

李玉為，張巧云，曹亞紅，王家友，李 銳

心肌缺血是缺血性心臟病患者發(fā)病和死亡的主要原因之一，往往需要溶栓或經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療，冠狀動(dòng)脈缺血一段時(shí)間后再灌注會(huì)進(jìn)一步加重心肌損傷。缺血預(yù)處理可以有效減輕心肌缺血再灌注損傷，研究表明傷害性刺激也可以產(chǎn)生類似的保護(hù)效應(yīng)。神經(jīng)病理性疼痛是軀體感覺(jué)神經(jīng)系統(tǒng)損傷或疾病引起的疼痛，但其對(duì)心肌缺血再灌注損傷是否有保護(hù)作用尚有爭(zhēng)議。心肌缺血再灌注損傷后自噬增強(qiáng)，與蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號(hào)通路有關(guān)。自噬細(xì)胞通過(guò)自身細(xì)胞器與溶酶體融合后降解，供新功能物質(zhì)合成，對(duì)細(xì)胞存活有利，但過(guò)度自噬會(huì)加重心肌缺血再灌注損傷。該研究擬觀察神經(jīng)病理性疼痛對(duì)大鼠心肌缺血再灌注的影響，并從細(xì)胞自噬的角度初步探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

42只雄性成年SD大鼠，體質(zhì)量250～320 g(10周齡)，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為為三組(

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=14)：對(duì)照組(Con組)、心肌缺血再灌注損傷組(I/R組)和神經(jīng)病理性痛+心肌缺血再灌注損傷組(NP+I/R組)。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境溫度控制為(22±1)℃，濕度控制為(40±15)%，晝夜節(jié)律按12 h/12 h進(jìn)行周期性調(diào)節(jié)飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑和儀器

2,2-聯(lián)喹啉-4,4-二甲酸二鈉(BCA) 蛋白定量試劑盒購(gòu)自上海碧云天科技研究所；HE染色試劑盒購(gòu)自南京建成生物研究所；AKT、p-AKT、p-mTOR、mTOR均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtube-associated protein 1 light chain 3，LC3)、β-actin均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；山羊抗兔和山羊抗鼠二抗均購(gòu)自北京中杉金橋生物科技有限公司；ECL發(fā)光試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；氯化三苯基四氮唑 ( 2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride,TTC) 購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；von Frey觸痛儀購(gòu)自美國(guó)IITC公司；BME 410A熱痛刺激儀購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所；HX-300S型動(dòng)物呼吸機(jī)購(gòu)自成都泰盟科技有限公司；PowerLab系統(tǒng)購(gòu)自澳大利亞AD公司；Tanon全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自上海天能科技有公司。

1.3 模型制備

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神經(jīng)病理性疼痛模型建立 根據(jù)文獻(xiàn)采用坐骨神經(jīng)慢性縮窄損傷(chronic constriction injury, CCI)法制備大鼠神經(jīng)病理性疼痛模型。腹膜注射戊巴比妥鈉45 mg/kg，大鼠麻醉后，在左下肢股骨下方約1 cm處切開(kāi)皮膚，于股二頭肌間隙鈍性肌肉分離，暴露坐骨神經(jīng)。用4-0鉻腸線結(jié)扎坐骨神經(jīng)干，間隔約1 mm，結(jié)扎4道，結(jié)扎坐骨神經(jīng)干時(shí)以見(jiàn)左下肢輕微震顫為度。NP+I/R組大鼠接受CCI術(shù)，Con組與I/R組僅暴露坐骨神經(jīng)，不結(jié)扎。

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心肌缺血再灌注損傷模型建立 在CCI術(shù)后第14天，根據(jù)參考文獻(xiàn)建立I/R損傷模型。加熱墊將其溫度保持在(37±1)℃，大鼠腹腔注射45 mg/kg的戊巴比妥鈉麻醉后氣管切開(kāi)，連接動(dòng)物呼吸機(jī)，設(shè)置呼吸頻率70～80次/min，潮氣量為20～30 ml/kg進(jìn)行機(jī)械通氣。右頸總動(dòng)脈切開(kāi)置管，通過(guò)壓力換能器，連接PowerLab系統(tǒng)，記錄有創(chuàng)平均動(dòng)脈壓(mean arterial pressure,MAP)和心電圖。沿左鎖骨中線切開(kāi)皮膚2 cm，在第4、5肋間開(kāi)胸，打開(kāi)心包膜暴露心臟。將帶有6-0 Prolene線的圓針在左耳下方2 mm處進(jìn)針，深度為1.0～1.5 mm，寬度為2～3 mm，從肺動(dòng)脈圓錐下出針。穩(wěn)定15 min后，通過(guò)拉緊線結(jié)形成左冠狀動(dòng)脈前降支閉塞，形成心肌缺血。I/R組和NP+I/R組大鼠心肌缺血30 min,再灌注120 min；而Con組僅進(jìn)行開(kāi)胸、穿線。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

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疼痛行為學(xué)評(píng)估 在術(shù)前、術(shù)后第3、7、14天時(shí)測(cè)定大鼠機(jī)械縮足反應(yīng)閾(mechanical withdrawal threshold,MWT)和熱縮足反應(yīng)潛伏期(thermal withdrawal latency,TWL)評(píng)價(jià)疼痛行為。將大鼠置于帶金屬網(wǎng)底的有機(jī)玻璃籠內(nèi)，待其適應(yīng)環(huán)境30 min后，手平持von Frey觸痛儀的刺激針緩慢接觸大鼠左側(cè)足底，記錄大鼠突然出現(xiàn)縮足反應(yīng)時(shí)的數(shù)值。重復(fù)測(cè)量3次，間隔時(shí)間大于10 s，取其平均值作為MWT，評(píng)價(jià)機(jī)械痛閾。將大鼠置于底部為特制玻璃(2 mm厚度)的籠內(nèi)，適應(yīng)環(huán)境30 min后，采用BME 410A熱痛刺激儀熱輻射光源照射左側(cè)足底，記錄從照射開(kāi)始至大鼠出現(xiàn)快速抬足反應(yīng)的時(shí)間。重復(fù)測(cè)定3次，每次間隔10 min，取其平均值作為TWL，評(píng)價(jià)熱痛閾。

1.4.2

心律失常評(píng)分 連續(xù)記錄心電圖,于再灌注30 min內(nèi)記錄室性早搏(premature ventricular contraction, PVCs)及室性心動(dòng)過(guò)速/心室顫動(dòng)(ventricular tachycardia/ventricular fibrillation, VT/VF)發(fā)生次數(shù)。心律失常評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：記錄時(shí)間內(nèi)PVCs<50次為0分；記錄時(shí)間內(nèi)發(fā)生PVCs 50～499 次記1分；記錄時(shí)間內(nèi)發(fā)生PVCs≥500次和(或)短暫的自發(fā)性VT/VF記2分；記錄時(shí)間內(nèi)發(fā)生短暫的自發(fā)性VT/VF，總持續(xù)時(shí)間不到1 min記3分，1～2 min記4分，>2 min記5分。

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心肌梗死面積測(cè)定 在心肌缺血再灌注結(jié)束后，采用頸椎脫臼法處死大鼠，取出心臟用0.1 mmol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)灌注沖去血液，然后扎緊左冠狀動(dòng)脈處的線結(jié)，從主動(dòng)脈逆行灌注0.25%伊文思藍(lán)(evans blue)染料0.5 ml，置于-80 ℃冰箱冷凍。將冷凍心臟切成5～6片，厚2 mm，置于1%TTC，37 ℃下溫孵10 min后用10%甲醛固定。使用Imaging J軟件(Version 1.45,美國(guó))分析左室(left ventricle, LV)、右心室(right ventricle, RV)、心臟缺血危險(xiǎn)區(qū)(area at risk, AAR)和梗死區(qū)(infarct size, IS)面積和IS/AAR值。

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HE染色 取結(jié)扎部位以下心臟組織置于4%多聚甲醛中固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋、切片。切片經(jīng)脫蠟后水洗，蘇木精染色、95%乙醇分色、水洗、反藍(lán)，然后0.5%伊紅液中染色、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片。

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Western blot實(shí)驗(yàn) 取心臟標(biāo)本加入RIPA細(xì)胞裂解液100 μl，冰上研磨至液態(tài)，12 000 r/min離心30 min，留取上清液提取總蛋白，使用BCA試劑盒按照說(shuō)明書(shū)實(shí)驗(yàn)步驟測(cè)量總蛋白濃度。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠上樣30 μg蛋白，電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶封閉，洗膜后分別加入p-AKT一抗(1 ∶1 000)、AKT一抗(1 ∶1 000)、p-mTOR一抗(1 ∶1 000)、mTOR一抗(1 ∶1 000)、LC3一抗(1 ∶1 000)和β-actin一抗(1 ∶2 000)，4 ℃搖床孵育過(guò)夜。次日洗膜，二抗用山羊抗鼠IgG(1 ∶10 000)或山羊抗兔IgG(1 ∶10 000)室溫孵育1 h。洗膜后暗室使用ECL發(fā)光試劑盒顯影，在Tanon全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)中自動(dòng)曝光采集圖像。

2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)流程如圖1。在NP+I/R組中，2只大鼠未成功建立神經(jīng)病理性疼痛模型，1只大鼠心肌缺血期間出現(xiàn)嚴(yán)重心律失常；I/R組中有3只大鼠在缺血再灌注期間死亡。此6只大鼠均予以剔除。

圖1 實(shí)驗(yàn)示意圖

2.1 大鼠的MWT和TWL數(shù)值變化

Con組、I/R組、NP+I/R組三組術(shù)前MWT和TWL基礎(chǔ)值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與Con組和I/R組相比，NP+I/R組大鼠在CCI術(shù)后第3、7、14天的MWT和TWL降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)。Con組與I/R組各時(shí)點(diǎn)的MWT和TWL之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖2、表1。

表1 MWT和TWL數(shù)值

圖2 大鼠的MWT和TWL數(shù)值A(chǔ)：MWT；B：TWL；與I/R組比較：*P<0.05

2.2 MAP及心率

三組MAP和心率(heart rate，HR)基礎(chǔ)值之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與Con組相比，I/R組和NP+I/R組MAP、HR在缺血30 min時(shí)刻和再灌注120 min時(shí)刻降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)。但I(xiàn)/R組與NP+I/R組之間MAP和HR差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)血壓及心率情況

2.3 心律失常評(píng)分

與Con組相比，I/R組和NP+ I/R組的心律失常評(píng)分增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)，見(jiàn)圖3。

圖3 心律失常評(píng)分

2.4 心肌梗死面積

三組之間AAR/(LV+RV)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與Con組相比，I/R組IS/AAR增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)；與I/R組相比，NP+I/R組IS/AAR降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)。見(jiàn)圖4及表3。

圖4 三組大鼠心臟TTC染色結(jié)果

表3 各組大鼠心肌梗死面積比較

2.5 HE染色

Con組心尖部心肌纖維排列整齊；I/R組心尖部心肌纖維排列紊亂，可見(jiàn)壞死灶，水腫明顯；NP+I/R組心尖部心肌纖維排列紊亂，壞死灶和水腫較I/R組輕。見(jiàn)圖5。

圖5 三組心肌組織學(xué)比較 HE ×200A：Con組；B：I/R組；C：NP+I/R組

2.6 AKT、mTOR及LC3蛋白分子表達(dá)情況

與Con組相比，I/R組心尖部心肌組織的p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR表達(dá)下調(diào)，LC3-Ⅱ/Ⅰ表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)。與I/R組相比，NP+I/R組心尖部心肌組織的p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR比值上調(diào)，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)。見(jiàn)圖6。

圖6 Western blot檢測(cè)AKT、mTOR及LC3等蛋白表達(dá)情況

3 討論

坐骨神經(jīng)CCI法是制備神經(jīng)病理性疼痛模型的經(jīng)典手術(shù)方式。CCI術(shù)后大鼠術(shù)側(cè)的下肢會(huì)出現(xiàn)蜷縮、無(wú)法負(fù)重等表現(xiàn)。MWT和TWL值顯著降低為神經(jīng)病理性疼痛模型建立成功的標(biāo)志。 在CCI術(shù)后第14天制備缺血再灌注模型，心臟結(jié)扎部位以下的組織明顯發(fā)紺，HR、血壓下降，心電圖顯示ST段抬高和QRS波寬大畸變，以上情況提示成功建立了心肌缺血再灌注損傷模型。

神經(jīng)病理性疼痛產(chǎn)生可能與其外周和中樞敏化相關(guān)，另外膠質(zhì)細(xì)胞的激活擴(kuò)散也參與神經(jīng)病理性疼痛的形成。一般情況下，末梢神經(jīng)元受到諸如疼痛之類的有害刺激時(shí)，電信號(hào)將傳導(dǎo)至一級(jí)神經(jīng)元，即脊髓背根神經(jīng)節(jié)(DRG)，隨后傳遞至脊髓、丘腦，產(chǎn)生痛覺(jué)。該研究顯示病理性疼痛減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷后心肌梗死面積,這與Cheng et al研究結(jié)果一致，其在小鼠脊神經(jīng)損傷5 d后行心肌缺血再灌注損傷耐受實(shí)驗(yàn)，同樣觀察到神經(jīng)損傷組心肌梗死面積減少，且認(rèn)為其心肌保護(hù)作用與丘腦室旁前核的調(diào)節(jié)有關(guān)。

細(xì)胞自噬屬于一種保守的分解代謝機(jī)制，在基礎(chǔ)或應(yīng)激情況下，細(xì)胞雙層膜將胞內(nèi)錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)、受損的細(xì)胞器吞噬，成為自噬小體，隨后與溶酶體融合而被降解。故細(xì)胞自噬在循環(huán)利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、平衡細(xì)胞能量及促進(jìn)細(xì)胞存活等方面起著重要作用，但細(xì)胞過(guò)度自噬也會(huì)加重心肌細(xì)胞損傷。在自噬發(fā)生過(guò)程中，胞質(zhì)內(nèi)的Ⅰ型 LC3 經(jīng)過(guò)泛素樣加工修飾后再與自噬膜上的磷脂酰乙醇胺結(jié)合并形成Ⅱ型 LC3，因此，檢測(cè)LC3-Ⅱ/Ⅰ可以反應(yīng)自噬發(fā)生的程度。自噬不但參與疼痛的調(diào)控，對(duì)缺血再灌注損傷也產(chǎn)生調(diào)控作用。Izumi et al在足底切口痛模型大鼠的DRG神經(jīng)元上觀察到p-mTOR表達(dá)增多，Liu et al在神經(jīng)病理性疼痛模型的L4-L5脊髓上也觀察到p-AKT、p-mTOR表達(dá)增多。另外，趙其宏 等發(fā)現(xiàn)嗎啡后處理可致體外實(shí)驗(yàn)觀察到缺血再灌注損傷心肌梗死面積減少，并且該心肌保護(hù)機(jī)制與抑制心肌過(guò)度自噬相關(guān)。該研究表明心肌缺血再灌注損傷引起心肌AKT和mTOR表達(dá)減少，LC3蛋白表達(dá)增加；而神經(jīng)病理性疼痛大鼠心肌缺血再灌注損傷后AKT和mTOR表達(dá)增加，自噬相關(guān)蛋白LC3表達(dá)減少，即神經(jīng)病理性疼痛的心肌保護(hù)作用可能與過(guò)度自噬的減輕有關(guān)。此外，該研究顯示神經(jīng)病理性疼痛大鼠心律失常評(píng)分降低，心肌組織形態(tài)學(xué)上心肌排列紊亂及壞死、水腫程度減輕。因此，神經(jīng)病理性疼痛減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷可能與神經(jīng)病理性疼痛調(diào)控AKT/mTOR信號(hào)通路抑制細(xì)胞過(guò)度自噬有關(guān)。