高脂飲食對(duì)大鼠海馬形態(tài)及突觸相關(guān)蛋白Synapsin-1表達(dá)的影響

劉 森，陳 征，高欣冉，彭 磊，葛金芳

高脂血癥是一種臨床常見(jiàn)的脂質(zhì)代謝紊亂綜合征，其病因?yàn)橹敬x或轉(zhuǎn)運(yùn)異常導(dǎo)致血液中單種或多種脂質(zhì)水平明顯升高，主要表現(xiàn)為高膽固醇血癥、高三酰甘油血癥或混合型高脂血癥。雖然大多數(shù)高脂血癥患者初期并無(wú)明顯的臨床癥狀，但高脂血癥已被證明是心腦血管疾病發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，并與包括阿爾茨海默病在內(nèi)的多種神經(jīng)精神疾病密切相關(guān)。課題組前期研究表明，高脂飲食不僅可誘導(dǎo)大鼠糖脂代謝紊亂，還可導(dǎo)致以學(xué)習(xí)記憶能力下降為主要表現(xiàn)的神經(jīng)精神行為異常，但具體機(jī)制尚未完全明確。

該研究擬采用高脂飲食喂養(yǎng)方法建立大鼠模型，進(jìn)而觀察大鼠海馬形態(tài)及突觸相關(guān)蛋白Synapsin-1(Syn-1)表達(dá)的改變，旨在為進(jìn)一步闡明高脂血癥誘導(dǎo)神經(jīng)精神損傷的發(fā)生機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1

.

1

.

1

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量(160±10)g，購(gòu)買于安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)條件為12 h/12 h晝夜交替光照，溫度20～24 ℃，濕度45%～75%，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周之后開始實(shí)驗(yàn)。

1

.

1

.

2

主要試劑 高脂飼料和標(biāo)準(zhǔn)飼料購(gòu)于南通特洛菲飼料科技公司；水合氯醛購(gòu)自北京索萊寶生物科技公司；HE染液和硝酸銀試劑購(gòu)自武漢塞維爾生物科技公司；Syn-1一抗購(gòu)自美國(guó)immunoway公司。

1.2 方法

1

.

2

.

1

大鼠分組 將18只SD大鼠隨機(jī)分配至對(duì)照組及模型組，其中對(duì)照組8只，模型組10只。模型組大鼠予以高脂飼料(每公斤含豬油301 g、酪蛋白267 g、糊精157 g、蔗糖89 g、纖維素67 g、礦物質(zhì)66 g、豆油33 g、維生素13 g)喂養(yǎng)，對(duì)照組大鼠予以標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。所有大鼠均自由飲食。

1

.

2

.

2

大鼠血清的采集與生化檢測(cè) 大鼠喂養(yǎng)4周后，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的水合氯醛對(duì)其進(jìn)行腹腔注射，待其完全麻醉后采用腹主動(dòng)脈取血法采集血液標(biāo)本。采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清總膽固醇(total cholesterol, TC)、三酰甘油(triglyceride, TG)、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein, HDL)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein, LDL)的水平；采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)檢測(cè)瘦素濃度。

1

.

2

.

3

大鼠腦組織取材 大鼠采集血液樣本后放干其體內(nèi)剩余血液，在各組中隨機(jī)選取4只大鼠斷頭取全腦，用4%多聚甲醛固定備用。另有4只大鼠取腦之后在冰上快速分離出海馬組織并放入液氮中快速冷凍，隨即轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱中保存。

1

.

2

.

4

腦HE染色 將4%多聚甲醛固定后的腦組織用梯度乙醇進(jìn)行脫水處理，二甲苯脫脂透明，再用石蠟包埋，制成蠟塊，6 μm連續(xù)切片，經(jīng)二甲苯以及梯度乙醇脫蠟至水后進(jìn)行HE染色，脫水透明，再采用中性樹膠將切片封存，最后進(jìn)行顯微鏡觀察并采集圖像。

1

.

2

.

5

腦鍍銀染色 石蠟切片(6 μm)脫蠟至水后進(jìn)行硝酸銀染色：用免疫組化筆對(duì)組織描圈后滴加5%的硝酸銀于組織上，濕盒反應(yīng)20 min；再用蒸餾水清洗2次，即時(shí)配制銀氨溶液滴加于組織上，避光作用15 min；將切片浸泡于稀氨水，配制并取適量顯影液與組織反應(yīng)5 min左右，在顯微鏡下觀察顯色反應(yīng)，當(dāng)神經(jīng)纖維呈現(xiàn)黑色時(shí)，將顯影液倒去并用蒸餾水沖洗2次；將顯色后的切片用5%的硫代硫酸鈉處理5 min，對(duì)切片進(jìn)行脫水封存，在顯微鏡下觀察并進(jìn)行圖像采集。

1

.

2

.

6

qRT-PCR法檢測(cè)海馬中Syn-1mRNA的表達(dá)水平 從分離的海馬組織中提取總mRNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，采用qRT-PCR儀對(duì)Syn-1進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增體系共10 μl，其中SYBR Premix Ex Taq II(TliRNaseH Plus) (2×)5.0 μl，上下游引物(10 μmol/L)各0.3 μl，cDNA3.0 μl，無(wú)酶DEPC水1.4 μl。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，隨即進(jìn)行PCR循環(huán)，循環(huán)條件為95 ℃反應(yīng)10 s，55 ℃反應(yīng)30 s，總共進(jìn)行40次循環(huán)。Syn-1及內(nèi)參β-actin的引物序列見(jiàn)表1。采用2法定量分析Syn-1的表達(dá)水平。

表1 Syn-1和內(nèi)參β-actin引物序列

1

.

2

.

7

免疫組織化學(xué)染色 大鼠腦組織用4%多聚甲醛固定，經(jīng)30%蔗糖進(jìn)行脫水、石蠟包埋后進(jìn)行6 μm切片。采用枸椽酸鈉進(jìn)行高溫修復(fù)后，使用過(guò)氧化氫對(duì)內(nèi)源性過(guò)氧化物酶進(jìn)行阻斷，使用Syn-1抗體(1 ∶1 000)在4 ℃條件下孵育過(guò)夜。次日用PBS緩沖液洗滌，用HRP 標(biāo)記的二抗在室溫下孵育1 h，用DAB顯色液顯影后進(jìn)行顯微鏡觀察并拍照，并使用Image Pro Plus 6.0軟件對(duì)免疫組織化學(xué)結(jié)果圖中陽(yáng)性棕褐色產(chǎn)物進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果

2.1 高脂飲食對(duì)大鼠血清脂質(zhì)水平的影響

與對(duì)照組相比，模型組中大鼠血清TC、HDL、LDL水平升高，且瘦素水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.01)，而TG水平有一定的升高趨勢(shì)，但兩組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見(jiàn)表2。

表2 高脂飲食對(duì)大鼠血清脂質(zhì)濃度的影響

2.2 高脂飲食對(duì)大鼠海馬形態(tài)學(xué)的影響

HE染色結(jié)果表明，對(duì)照組海馬CA1、CA3及DG區(qū)的神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)正常，分布緊密，細(xì)胞核圓且大，并且能夠清楚地看到核仁，切片中無(wú)深染的神經(jīng)元。高脂飲食模型組各區(qū)中神經(jīng)元細(xì)胞分布松散，且萎縮變形，細(xì)胞核與胞漿之間的界限不明，并且大量細(xì)胞已變性，在切片處出現(xiàn)細(xì)胞核固縮、深染，見(jiàn)圖1。鍍銀染色結(jié)果顯示，對(duì)照組海馬CA1、CA3及DG區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞分布疏松且整齊，未見(jiàn)神經(jīng)元深染，而高脂飲食模型組中海馬各區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞深染，排列緊密無(wú)序，且神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生大量變性，見(jiàn)圖2。

圖1 高脂飲食對(duì)大鼠海馬CA1、CA3、DG區(qū)形態(tài)學(xué)的影響 HE染色 ×100

圖2 高脂飲食對(duì)大鼠海馬CA1、CA3、DG區(qū)形態(tài)學(xué)的影響 鍍銀染色 ×100

2.3 高脂飲食對(duì)大鼠海馬組織中Syn-1 mRNA表達(dá)的影響

采用qRT-PCR法檢測(cè)兩組大鼠海馬組織Syn-1 mRNA表達(dá)情況，結(jié)果如圖3所示。與對(duì)照組比較，模型組海馬組織的Syn-1 mRNA的表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

t

=2.612，

P

=0.021)。

圖3 高脂飲食對(duì)大鼠海馬Syn-1 mRNA表達(dá)的影響與對(duì)照組比較：*P<0.05

2.4 高脂飲食對(duì)大鼠海馬組織中Syn-1蛋白表達(dá)的影響

本研究中免疫組織化學(xué)染色后海馬組織中

出現(xiàn)明顯深棕色或棕褐色顆粒為Syn-1蛋白表達(dá)陽(yáng)性。在對(duì)照組中，Syn-1棕褐色陽(yáng)性產(chǎn)物主要表達(dá)在在海馬CA1、CA3、DG區(qū)中，且棕褐色顆粒樣物質(zhì)數(shù)量較模型組多且顏色更深。模型組CA1、CA3、DG區(qū)中Syn-1免疫陽(yáng)性產(chǎn)物表達(dá)較對(duì)照組降低，兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖4、5。

圖4 高脂飲食對(duì)大鼠海馬Syn-1蛋白表達(dá)的影響 免疫組織化學(xué)染色 ×100

3 討論

高脂飲食在基礎(chǔ)研究中常用于構(gòu)建糖尿病、高脂血癥以及非酒精性脂肪肝等多種動(dòng)物模型。研究表明，血脂異常，尤其是膽固醇水平的升高會(huì)增加淀粉樣蛋白的聚集，繼而加速阿爾茨海默病等神經(jīng)精神疾病的發(fā)生發(fā)展。本課題組前期研究結(jié)果表明高脂飲食不僅能夠誘導(dǎo)大鼠出現(xiàn)高糖血

圖5 脂飲食對(duì)大鼠海馬CA1、CA3、DG區(qū)Syn-1蛋白表達(dá)的影響與對(duì)照組比較：**P<0.01

癥、高脂血癥等代謝紊亂表現(xiàn)，還可導(dǎo)致其學(xué)習(xí)記憶功能障礙等神經(jīng)精神行為學(xué)異常。與上述結(jié)果相一致的是，本研究結(jié)果表明，高脂飲食連續(xù)喂養(yǎng)4周可導(dǎo)致大鼠血清TC、LDL濃度升高，瘦素水平下降；與此同時(shí)，模型組大鼠血清HDL濃度也較對(duì)照組顯著上升；這可能是機(jī)體的代償性反應(yīng)，也可能是高脂血癥發(fā)展過(guò)程中不同病程的變化。

研究表明，高脂飲食不僅可誘導(dǎo)大鼠糖脂代謝紊亂，還可導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)的形態(tài)學(xué)改變。海馬作為邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，是公認(rèn)的與學(xué)習(xí)記憶等功能密切相關(guān)的腦區(qū)，在學(xué)習(xí)記憶和情感等方面起著極為重要的作用。本研究中的鍍銀染色結(jié)果表明，模型組海馬CA1、CA3及DG區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生明顯萎縮，并且出現(xiàn)大量變性；結(jié)果提示海馬腦區(qū)內(nèi)神經(jīng)元的異常變性可能為高脂飲食誘導(dǎo)大鼠發(fā)生學(xué)習(xí)記憶功能障礙的原因之一。

突觸可塑性是神經(jīng)元突觸能夠健康有序地發(fā)生變化，從而使得神經(jīng)元形成完整的功能性回路，是大腦學(xué)習(xí)記憶功能的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。作為參與突觸可塑性調(diào)節(jié)的主要蛋白之一，Syn-1能夠與鈣離子的結(jié)合從而參與突觸囊泡融合以及神經(jīng)遞質(zhì)釋放，在認(rèn)知功能的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。研究表明，阿爾茨海默病患者癡呆前期，血漿中神經(jīng)元來(lái)源的外泌體中的Syn-1的表達(dá)顯著降低并與認(rèn)知功能下降密切相關(guān)。并且Joshi et al的研究表明經(jīng)過(guò)連續(xù)用抗精神病藥物兩周的大鼠海馬中Syn-1的表達(dá)顯著升高，這一結(jié)果提示海馬內(nèi)Syn-1的表達(dá)水平可能與神經(jīng)精神損傷程度成負(fù)相關(guān)。在本研究中，qRT-PCR及免疫組織化學(xué)結(jié)果表明模型組大鼠海馬中Syn-1表達(dá)相較于對(duì)照組明顯下降，這一結(jié)果與各組海馬鍍銀染色形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果提示海馬腦區(qū)的結(jié)構(gòu)及突觸可塑性改變可能是高脂飲食誘導(dǎo)神經(jīng)精神損傷的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制之一。

綜上所述，高脂飲食不僅能夠誘導(dǎo)大鼠脂質(zhì)代謝紊亂，還可導(dǎo)致海馬區(qū)域神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能的異常變化。海馬形態(tài)學(xué)改變及Syn-1表達(dá)下調(diào)可能是高脂飲食誘導(dǎo)神經(jīng)精神損傷的可能機(jī)制。