miR-223在甲型流感病毒誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞炎癥中的作用機制

劉翠翠，尚立群，段進進，陳瑞琳，張永慶，楊淑梅

NOD樣受體蛋白(NOD-like receptor protein，NLRP)家族是NLR的重要成員，其中NOD樣受體蛋白3(NLRP3)炎癥小體是由NLRP3、凋亡相關(guān)斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1前體(pro-cysteine-aspartic acid protease 1，Pro-Caspase-1)組裝成的多蛋白復(fù)合體，可將Pro-Caspase-1剪切為有活性的Caspase-1，進而剪切白細(xì)胞介素前體(pro-interleukin，Pro-IL)包括Pro-IL-1β、Pro-IL-18和Pro-IL-33形成有活性的成熟IL-1β、IL-18和IL-33，分泌至細(xì)胞外，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和誘導(dǎo)免疫病理損傷。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長度約為20～24個核苷酸的內(nèi)源小RNA，其介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控在基因表達的控制中發(fā)揮重要作用。研究表明，微小RNA-223(microRNA-233，miR-223)能夠特異性作用于

NLRP

3 mRNA的3′-UTR區(qū)，從而抑制NLRP3的翻譯表達。在病毒入侵時，為了避免引起免疫反應(yīng)，機體會釋放miRNA抑制NLRP3炎癥小體的激活。目前，關(guān)于miR-223在流感病毒引起的肺部損傷中作用的研究報道較少。該研究旨在探究miR-223對流感病毒引起的肺部損傷的作用及其機制，為臨床上流感的治療提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

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1 材料

收集甲型流感患者32例和正常受試者32例的血清樣本，所有患者均知情同意，且本研究已獲國家科研倫理委員會批準(zhǔn)。正常人肺上皮細(xì)胞(bronchial epithelial cells, BEAS-2B)購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，以及甲型流感病毒(influenza A virus, IAV，A/Puerto Rico/8/34/H1N1)(于9～11 d的可育SPF雞蛋的尿囊內(nèi)繁殖)。RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國HyClone公司；TRIzol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)試劑盒購自美國Promega公司；BCA蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司；兔抗鼠NLRP3、兔抗鼠Bax、兔抗鼠Caspase-3、兔抗鼠Bcl-2和鼠抗GAPDH購自美國Abcam公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000購自美國Invitrogen公司；PCR引物、miR-223 mimic以及陰性對照NC mimic由北京擎科生物科技有限公司設(shè)計、合成。

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2 實驗方法

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細(xì)胞培養(yǎng) 本研究所有細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素及0.1 mg/ml鏈霉素)，置于37 ℃、5% CO的細(xì)胞培養(yǎng)箱，隔天換液，細(xì)胞融合至80%～90%時傳代，傳至第3代進行后續(xù)實驗。

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2

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細(xì)胞處理 使用犬腎上皮細(xì)胞系MDCK來測定病毒的滴度，感染復(fù)數(shù)(MOI)為1。使用IAV病毒侵染BEAS-2B細(xì)胞，時間分別為12、24、36、48 h，測定細(xì)胞活力，后選取最適處理時間(36 h)進行后續(xù)實驗。使用RT-qPCR檢測不同處理組細(xì)胞中miR-223或NLRP3的表達情況。

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3

實驗分組 將細(xì)胞分為未處理組、IAV組、IAV+NC mimic組、IAV+miR-223 mimic組。IAV病毒侵染的BEAS-2B細(xì)胞為IAV組；未感染IAV病毒的BEAS-2B細(xì)胞為未處理組；IAV病毒侵染BEAS-2B細(xì)胞36 h后用Lipofectamine3000將陰性對照NC mimic以及miR-223 mimic分別轉(zhuǎn)染至BEAS-2B細(xì)胞中，分別為IAV+NC mimic組和IAV+miR-223 mimic組。

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4

RT-qPCR檢測mRNA表達 TRIzol法提取BEAS-2B細(xì)胞中總RNA，進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。RT-qPCR檢測miR-223基因的mRNA表達，β-actin為內(nèi)參。引物序列如下：miR-223正向序列為5′-ACGTTAGCTACACTTGCGTT-3′，反向序列為5′-AGTGCCGTTGCATACAAAGG-3′；β-actin正向序列為5′-CTCACCATGGATGATGATATCGC-3′，反向序列為5′-AGGAATCCTTCTGACCACTGC-3′。以2法計算基因相對表達量。

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5

Western blot檢測蛋白表達 消化對數(shù)生長期的BEAS-2B細(xì)胞，接種于25 cm培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞融合至80%～90%時進行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。48 h后收集各組細(xì)胞，收集細(xì)胞上清液，并消化下貼壁細(xì)胞，加RIPA裂解液于冰上裂解10 min，4 ℃、12 000 r/min離心30 min(離心半徑9.5 cm)。上清液用BCA蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒測定蛋白含量后，取30 μg蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，130 V恒壓電泳2 h；濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；室溫下以含5%脫脂奶粉的Tris緩沖液封閉PVDF膜1 h，沖洗后分別與一抗孵育，4 ℃過夜；TBST清洗膜8 min，重復(fù)4次，加相應(yīng)的辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h；TBST重復(fù)清洗膜4次，ECL試劑盒檢測蛋白表達。

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6

細(xì)胞活力的檢測 將各組細(xì)胞以1×10個/孔的密度接種于96孔板中，于37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；向培養(yǎng)板中加入IAV病毒分別于37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12、24、36、48 h，每個分組設(shè)3個復(fù)孔并設(shè)空白對照，每孔加入20 μl CCK-8溶液，孵育24 h；酶標(biāo)儀測定450 nm處的OD值。以上實驗重復(fù)3次，取平均值。

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細(xì)胞凋亡率的測定 將miR-223 mimic以及陰性對照NC mimic分別轉(zhuǎn)染BEAS-2B細(xì)胞，于37 ℃、5% CO條件下培養(yǎng)48 h；將細(xì)胞以1×10個/孔的密度接種在6孔板中。根據(jù)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒的說明，用冷的PBS將細(xì)胞洗滌2次，然后用細(xì)胞凋亡檢測試劑盒中的膜聯(lián)蛋白V-FITC/PI染色。細(xì)胞凋亡率用流式細(xì)胞儀分析。以上實驗重復(fù)3次。

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2

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8

活性氧(reactive oxygen species，ROS)的測定 將BEAS-2B細(xì)胞以1×10個/孔的密度接種于6孔板中，于37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；收集細(xì)胞，在37 ℃下用ROS指示劑DCFH-DA(10 μmol/L)在PBS中培養(yǎng)30 min。使用流式細(xì)胞儀分析熒光。實驗獨立重復(fù)3次。

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2

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9

miR-223與NLRP3表達量的相關(guān)性分析 繪制散點圖來判斷miR-223與NLRP3表達量之間的關(guān)系形態(tài)。相關(guān)系數(shù)根據(jù)樣本數(shù)據(jù)計算的miR-223與NLRP3表達量之間線性關(guān)系強度的統(tǒng)計量。具體計算公式：

r

=

Cov

(

x

,

y

)

/σ

σ

。

2 結(jié)果

2.1 miR-223在IAV感染的患者血清和細(xì)胞中的表達

RT-qPCR結(jié)果顯示，miR-223在流感患者血清中的相對表達量低于正常受試者中的表達，而

NLRP

3在流感患者中的相對表達量高于正常受試者中的表達(圖1A、B)。進一步的研究表明，BEAS-2B細(xì)胞經(jīng)IAV處理后，細(xì)胞活力隨時間降低(圖1C)。此外，用IAV處理BEAS-2B細(xì)胞后，miR-223的相對表達量降低，而

NLRP

3的相對表達量增加，且具有時間依賴性(圖1D、E)。

圖1 miR-223在IAV感染的患者血清和細(xì)胞中的表達

2.2 過表達miR-223對BEAS-2B細(xì)胞的炎癥和氧化應(yīng)激的影響

與未處理組相比，IAV處理組炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α的水平顯著升高；而將IAV處理的細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-223 mimic后，炎癥因子的水平降低(

F

=5.269，

P

=0.031 1，圖2A～C)。此外，與IVA組或IVA+NC mimic組相比，IAV+miR-223 mimic組細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著降低(

F

=7.358，

P

=0.021 6，圖2D)，同樣細(xì)胞內(nèi)NAD的水平也明顯下降(

F

=15.872，

P

=0.009 5，圖2E)。

圖2 過表達miR-223對BEAS-2B細(xì)胞炎癥和氧化應(yīng)激的影響

2.3 過表達miR-223對BEAS-2B細(xì)胞凋亡的影響

當(dāng)細(xì)胞經(jīng)IAV處理后，細(xì)胞活力降低，而轉(zhuǎn)染miR-223 mimic使IAV處理的細(xì)胞活力顯著升高(

F

=3.125，

P

=0.042 3，圖3A)；此外，與IAV組相比，IAV+miR-223 mimic組細(xì)胞的凋亡率降低(

F

=13.687，

P

=0.006 5，圖3B)，且細(xì)胞中Caspase-3和Caspase-9的蛋白表達水平和凋亡相關(guān)蛋白Bax/Bal-2的比值降低(

F

=5.544，

P

=0.026 8，圖3C～E)。

圖3 過表達miR-223對BEAS-2B細(xì)胞凋亡的影響

2.4 過表達miR-223對NLRP3的表達以及TLR4/NF-κB通路蛋白表達的影響

與IAV組相比，IAV+NC mimic組NLR3P蛋白表達水平降低(

F

=6.766，

P

=0.041 1，圖4A、B)；此外，與IAV組相比，IAV+NC mimic組TLR4和p-p65蛋白水平也顯著下降(

F

=10.264，

P

=0.008 7，圖4C、D)；通過對32個流感患者血清中miR-223和NLRP3表達量的相關(guān)性分析顯示，二者表達量呈負(fù)相關(guān)(

F

=8.967，

P

=0.025 4，圖4E)。

圖4 過表達miR-223對NLRP3的表達以及TLR4/NF-κB通路蛋白表達的影響

2.5 miR-223保護IAV誘導(dǎo)的BEAS-2B免受損傷的調(diào)控機制

CCK-8檢測結(jié)果顯示，與IAV組相比，IAV+miR-223 mimic組的細(xì)胞活力增加；IAV+pcDNA3.1-TLR4組和IAV+pcDNA3.1-NLRP3組細(xì)胞活力均減弱(

F

=12.364，

P

=0.0268，圖5A)，且IL-1β和ROS的表達水平增加，且細(xì)胞凋亡率升高。IAV+pcDNA3.1-NLRP3組和IAV+ miR-223 mimic+pcDNA3.1-TLR4組IL-1β、ROS水平和細(xì)胞凋亡率顯著低于IAV+miR-223 mimic組，與IAV組無顯著性差異(

F

=2.168，

P

=0.048 7，圖5B～D)；此外，與IAV組相比，IAV+miR-223 mimic組細(xì)胞中Caspase-3的表達水平明顯降低；IAV+pcDNA3.1-NLRP3組和IAV+ miR-223 mimic+pcDNA3.1-TLR4組Caspase-3的表達量顯著高于IAV+miR-223 mimic組，與IAV組無顯著性差異(

F

=11.257，

P

=0.013 6，圖5E)。

圖5 TLR4/NF-κB通路和NLRP3參與miR-223對IAV誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的保護機制

3 討論

IAV可引起反復(fù)流行，造成人類高發(fā)病率和病死率。因此深入研究IAV的感染致病及免疫反應(yīng)的機制，對研發(fā)流感病毒疫苗和抗病毒藥物具有深遠意義。該研究表明miR-223在IAV感染的患者血清細(xì)胞中的表達均下調(diào)，提示miR-223可能與IAV感染過程具有一定的相關(guān)性。miR-223廣泛參與調(diào)控細(xì)胞的生物學(xué)過程和多種病理過程，如癌癥、自身免疫性疾病和炎癥性疾病。該研究表明過表達miR-223可抑制IAV誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞炎癥，這與郝俊芳 等在LPS誘導(dǎo)的小鼠乳腺上皮細(xì)胞所得到的結(jié)論一致。李蕓蕓 等指出miR-223可顯著降低心臟缺血再灌注后心機細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)。此外，miR-223還可抑制糖基化終產(chǎn)物誘導(dǎo)的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡。與前人的研究一致，該研究顯示過表達miR-223降低IAV誘導(dǎo)的BEAS-2B的細(xì)胞凋亡率。以上表明，IAV感染可使miR-223表達下調(diào)，過表達miR-223可緩解 IAV誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞損傷。

NLRP3炎癥小體信號通路在IAV感染后引起炎癥反應(yīng)，并可釋放炎癥因子放大炎癥反應(yīng)。當(dāng)IAV感染引起炎癥小體激活時，大量的炎性因子會誘導(dǎo)嚴(yán)重肺臟免疫病理損傷，如急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合征。Chung et al證實NLRP3炎癥小體活化后釋放的IL-1β破壞上皮細(xì)胞，并進一步誘導(dǎo)IL-6、TNF-α的產(chǎn)生，進而誘發(fā)細(xì)胞因子引起嚴(yán)重的急性肺損傷。越來越多的研究表明，miR-223能夠抑制NLRP3炎癥小體活化，進一步抑制炎癥性疾病的進展。此外，激活miR-223的轉(zhuǎn)錄顯著抑制炎性介質(zhì)NLRP3的活化，并降低IL-1β產(chǎn)生來防止炎癥損傷。Sha et al的研究表明，NLRP3在miR-223敲除小鼠表達水平升高，導(dǎo)致IL-1β產(chǎn)生和腸道炎癥易感性增加。該研究顯示miR-223抑制了NLRP3的活化以及TLR4/NF-κB信號通路的激活，且TLR4/NF-κB通路和NLRP3參與了miR-223對IAV誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的保護機制，表明miR-223可能是通過抑制TLR4/NF-κB信號通路并抑制NLRP3炎癥小體的活化來抑制IAV感染造成的BEAS-2B細(xì)胞損傷。