miR-138-5p靶向TCF4調(diào)節(jié)眼葡萄膜黑色素瘤細胞的惡性生物學行為

魏 麗，連紅梅，劉 鵬，劉興華，吳書一，劉萌萌

眼葡萄膜黑色素瘤是成人常見的一種眼內(nèi)原發(fā)性惡性腫瘤，起源于葡萄膜黑色素細胞，其具有易于增殖和轉(zhuǎn)移的特點。在各種原發(fā)性眼部腫瘤中，葡萄膜黑色素瘤發(fā)病率居于第二位，僅次于視網(wǎng)膜母細胞瘤。據(jù)報道，葡萄膜黑色素瘤預(yù)后較差，常發(fā)生肝轉(zhuǎn)移。葡萄膜黑色素瘤的發(fā)病機制目前尚不清楚，因此進一步探討其發(fā)病機制、提高對其診療水平具有現(xiàn)實意義。

microRNA是一種長度大約在220 bp的非編碼單鏈小RNA，其通過與靶信使RNA的3′非翻譯區(qū)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控基因表達。microRNA在多種腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移及凋亡等生物過程中都發(fā)揮著重要的作用。有研究表明，miR-138在不同癌癥中異常表達，其通過靶向許多與增殖、凋亡、侵襲和遷移相關(guān)的靶基因，起到抑癌作用。然而，miR-138-5p在眼葡萄膜黑色素瘤MuM-2B細胞中的調(diào)控機制少有報道。該研究重點探討miR-138-5p影響MuM-2B細胞的惡性生物學行為的作用機制。

1 材料與方法

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1 主要試劑和儀器

MuM-2B細胞系購自武漢普諾賽生命科技有限公司；miR-138-5p mimic (序列：5′-GCCGGACUAAGUGUUGUGGUCGA-3′)、mimic-NC (序列：5′-GCCGGACUAAGUGUUCACCAGCU-3′)、轉(zhuǎn)錄因子4(transcription factor 4,TCF4)過表達重組質(zhì)粒(pcDNA-TCF4)及其對照載體(pcDNA)購自廣州RiboBio公司；Lipofectamine? 2000、Superscript RNase H-逆轉(zhuǎn)錄酶購自美國Invitrogen公司；RNA purification system購自德國Qiagen公司；DNase-I購自瑞士Roche公司；隨機六聚體購自美國Sigma-Aldrich公司；含TCF4野生型/突變型的熒光素酶報告基因質(zhì)粒載體由上海Genepharm公司合成；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司；Giemsa染色液、1%結(jié)晶紫、10% SDS-PAGE、羊抗兔IgG-HRP、ECL化學發(fā)光檢測試劑盒購自北京索萊寶公司；10%胎牛血清購自美國Gibco公司；抗體TCF4(1 ∶1 000)、β-actin(1 ∶1 000)、鈣黏蛋白(E-cadherin，1 ∶1 000)、神經(jīng)鈣黏素(N-cadherin，1 ∶1 000)、波形蛋白(Vimentin，在蛋白印跡中，1 ∶1 000；在免疫組化實驗中，1 ∶200)、Ki67(1 ∶400)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor ，VEGF，1 ∶1 600)、SignalStain? Boost IHC檢測試劑、SignalStain DAB Substrate Kit購自美國CST公司。ABI Prism 7000系統(tǒng)購自美國Applied Biosystems公司；SYBR Green Master Mix購自Thermo Fisher公司；Ti2-U光學顯微鏡購自日本Nikon公司。

1

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2 細胞分組及轉(zhuǎn)染

1

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2

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1

miR-138-5p mimic轉(zhuǎn)染 將MuM-2B細胞分別為3組：對照組(control組)，miR-138-5p mimic陰性對照組(mimic-NC組)和miR-138-5p mimic組(mimic組)。嚴格按照制造商的使用說明，通過Lipofectamine? 2000將mimic和miR-NC分別轉(zhuǎn)染到MuM-2B細胞。轉(zhuǎn)染48 h后，RT-qPCR檢測miR-138-5p mimic單獨轉(zhuǎn)染效率。

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2

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2

TCF4過表達重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 將MuM-2B細胞分別為3組：對照組(control組)、TCF4過表達空載體組(pcDNA組)、TCF4過表達重組質(zhì)粒組(pcDNA-TCF4組)。將pcDNA-TCF4pcDNA分別轉(zhuǎn)染到MuM-2B細胞。轉(zhuǎn)染48 h后，RT-qPCR檢測TCF4單獨轉(zhuǎn)染效率。

1

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2

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3

miR-138-5p mimic和TCF4共轉(zhuǎn)染 確定miR-138-5p和TCF4分別轉(zhuǎn)染成功后，將miR-138-5p mimic和pcDNA-TCF4質(zhì)粒混合，進行共轉(zhuǎn)染。將細胞分為4組：對照組、mimic組、pcDNA-TCF4組、miR-138-5p mimic+ pcDNA-TCF4共轉(zhuǎn)染組(mimic+TCF4組)。用于后續(xù)功能實驗。

1.3 RT-qPCR實驗檢測mRNA的相對表達量

總RNA用RNA purification system提取。用DNase-I去除基因組DNA。用Superscript RNase H-逆轉(zhuǎn)錄酶和隨機六聚體從5 mg總RNA中制備cDNA。對于qRT-PCR，在ABI Prism 7000系統(tǒng)中，使用SYBR Green Master Mix和引物在優(yōu)化濃度下測定基因表達。RT-qPCR用于miRNA檢測的引物是根據(jù)桑格中心miRNA注冊表提供的序列設(shè)計的。U6 snRNA作為內(nèi)源性對照。檢測基因的引物如下：TCF4，5′-CAGACGGATTGGTGTGGTC-3′(正向引物)，5′-GCACTGTCATCGGAAGGAAC-3′(反向引物)；β-actin，5′-AGTGTGACGTGGACATCCGCAAAG-3′(正向引物)，5′-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3′(反向引物)。每個基因均生成標準曲線，擴增效率為90%～100%。通過閾值比較，確定基因表達的相對定量。所有結(jié)果均以β-actin為基準進行歸一化。

1.4 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測miR-138-5p和TCF4靶向關(guān)系

嚴格按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書，將TCF4野生型(wild type，wt)/突變型載體(mutant，mut)或(和)miR-138-5p mimic轉(zhuǎn)染入MuM-2B細胞中，培養(yǎng)48 h后，3 500 r/min離心2 min，小心吸取培養(yǎng)液棄去。PBS洗滌細胞后，再加入細胞裂解液，在室溫下震蕩 5～10 min，收集并在3 000 r/min條件下離心5 min，取上清液進行檢測。

1.5 克隆形成實驗檢測MuM-2B細胞增殖

將對照組、mimic組、TCF4組及mimic+TCF4組的MuM-2B細胞接種于6孔板中，每孔200個細胞，連續(xù)接種7 d。廢棄培養(yǎng)基，每個孔用PBS仔細洗2次。將集落在甲醇中固定20 min，然后用Giemsa染色液染色。統(tǒng)計≥50個細胞的集落數(shù)，計算集落形成效率。集落百分比=集落形成數(shù)/接種細胞數(shù)×100%。

1.6 Transwell實驗檢測MuM-2B細胞侵襲力

MuM-2B細胞經(jīng)胰蛋白酶處理后，接種于含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中，細胞數(shù)為3×10個/孔。培養(yǎng)24 h后，用棉簽將上層殘留的細胞取出。遷移后的細胞在室溫下用95%乙醇固定，然后用1%結(jié)晶紫染色。在光學顯微鏡下觀察每個孔的5個隨機區(qū)域的染色情況。

1.7 Western blot實驗檢測TCF4、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白相對表達量

用10% SDS-PAGE分離細胞和腫瘤中的蛋白，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在被5%脫脂牛奶封閉后，蛋白質(zhì)與第一抗體(TCF4、β-actin、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin)在4 ℃下孵育過夜。PBS洗滌，羊抗兔IgG-HRP孵育1 h。用ECL化學發(fā)光檢測試劑盒觀察這些條帶。

1.8 異種移植瘤建模檢測miR-138-5p過表達對移植瘤的影響

所有實驗都是根據(jù)動物實驗3R原則制定的，并且得到了倫理委員會的批準。BALB/c裸鼠20只，雄性，7周齡，購自BALB/c裸鼠購自卡文斯百格(蘇州)模式動物研究有限公司，許可證號：SCXK(蘇)2018-0002。恒溫(25±3)℃，濕度60%，12 h/12 h光暗循環(huán)，自由獲取食物和水。將小鼠分為2組：對照組、mimic組，每組10只。將轉(zhuǎn)染miR-138-5p的MuM-2B細胞皮下注射至右大腿形成移植瘤。注射后第30天測定腫瘤質(zhì)量。小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(200 mg/kg)實施安樂死，然后收集腫瘤組織用于后續(xù)的實驗。

1.9 免疫組化檢測Ki67、VEGF、Vimentin陽性細胞率

脫蠟、抗原修復、脫水后，用5%正常山羊血清封閉石蠟切片1 h，與抗體(Ki67、VEGF、Vimentin)共培養(yǎng)過夜。切片用TBST沖洗，與SignalStain? Boost IHC檢測試劑在室溫下孵育30 min。切片用SignalStain DAB Substrate Kit染色，在光學顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 miR-138-5p mimic與pcDNA-TCF4轉(zhuǎn)染效率的檢測

與對照組比較，mimic組的miR-138-5p表達上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(

F

=130.6，

P

<0.05，圖1A)；與對照組比較，pcDNA-TCF4組的TCF4 mRNA表達上調(diào)(

F

=197.2,

P

<0.05，圖1B)；實驗結(jié)果表明轉(zhuǎn)染有效。與對照組比較，mimic組的TCF4 mRNA(

F

=391.2,

P

<0.05，圖1C)和蛋白(

F

=58.02,

P

<0.05，圖1D)表達下調(diào)，pcDNA-TCF4組的TCF4 mRNA(

F

=391.2,

P

<0.05)和蛋白(

F

=58.02,

P

<0.05)表達上調(diào)；與pcDNA-TCF4組比較，mimic+TCF4組的TCF4 mRNA(

t

=14.12,

P

<0.05)和蛋白(

t

=6.519,

P

<0.05)表達下調(diào)。由此可見，miR-138-5p過表達可逆轉(zhuǎn)TCF4的表達上調(diào)。

圖1 miR-138-5p mimic與pcDNA-TCF4轉(zhuǎn)染效率的檢測

2.2 miR-138-5p與TCF4 的靶向關(guān)系

生物信息學軟件預(yù)測miR-138-5p與TCF4靶向結(jié)合位點。如圖2A所示，miR-138-5p靶向TCF4 mRNA 3′UTR的2 776 ～ 2 782位點。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C靶向關(guān)系:如圖2B所示，在TCF4-wt中，與miR-NC組比較，miR-138-5p組的熒光素酶活性降低(

t

=6.719，

P

<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義；而在TCF4-mut中，與miR-NC組比較，miR-138-5p組的熒光素酶活性相近，差異無統(tǒng)計學意義。由此驗證，miR-138-5p與TCF4為靶向關(guān)系。

圖2 MiR-138-5p靶向結(jié)合TCF4情況

2.3 克隆形成實驗檢測miR-138-5p與TCF4對MuM-2B細胞增殖的影響

與對照組比較，mimic組的細胞增殖下降(

F

=63.65,

P

<0.05)，而pcDNA-TCF4組的細胞增殖升高(

F

=63.65,

P

<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義；與pcDNA-TCF4組比較，mimic+TCF4組的細胞增殖下降(

F

=5.664,

P

<0.05)。以上結(jié)果表明miR-138-5p過表達逆轉(zhuǎn)了TCF4對MuM-2B細胞增殖的促進作用。見圖3。

圖3 MiR-138-5p與TCF4對MuM-2B細胞增殖的影響

2.4 Transwell實驗檢測miR-138-5p與TCF4對MuM-2B細胞侵襲能力的影響

與對照組比較，mimic組的侵襲細胞減少(

F

=35.76,

P

<0.05)，而pcDNA-TCF4組的侵襲細胞增加(

F

=35.76,

P

<0.05)；與pcDNA-TCF4組比較，mimic+TCF4組的侵襲細胞減少(

t

=3.809,

P

<0.05)。見圖4。結(jié)果表明miR-138-5p過表達逆轉(zhuǎn)了TCF4對MuM-2B細胞侵襲能力的促進作用。

圖4 miR-138-5p與TCF4對MuM-2B細胞侵襲能力的影響

2.5 miR-138-5p與TCF4對MuM-2B細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epidermal mesenchymal transformation，EMT)的影響

Western blot檢測EMT相關(guān)蛋白結(jié)果顯示：如圖5所示，與各對照組比較，mimic組的E-cadherin表達上調(diào)(

F

=304.2,

P

<0.05)，N-cadherin(

F

=30.91,

P

<0.05)和Vimentin(

F

=39.39,

P

<0.05)表達下調(diào)；而pcDNA-TCF4組的E-cadherin(

F

=304.2,

P

<0.05)表達下調(diào)，N-cadherin(

F

=30.91,

P

<0.05)和Vimentin(

F

=39.39,

P

<0.05)表達上調(diào)。與pcDNA-TCF4組比較，mimic+TCF4組的E-cadherin(

t

=6.332,

P

<0.05)表達上調(diào)，N-cadherin(

F

=4.000,

P

<0.05)和Vimentin(

F

=4.341,

P

<0.05)表達下調(diào)。結(jié)果表明miR-138-5p過表達逆轉(zhuǎn)了TCF4對MuM-2B細胞EMT的促進作用。

圖5 miR-138-5p與TCF4對MuM-2B細胞EMT的影響

2.6 miR-138-5p 的過表達對模型小鼠體內(nèi)移植瘤的影響

如圖6A所示，與miR-NC組比較，mimic組的腫瘤質(zhì)量減輕(

t

=5.926,

P

<0.05)。如圖6B所示，與miR-NC組比較，mimic組的miR-138-5p表達上調(diào)(

t

=8.944,

P

<0.05)。如圖6C、D所示，與miR-NC組比較，mimic組的TCF4 mRNA(

t

=26.84,

P

<0.05)和蛋白(

t

=7.889,

P

<0.05)表達下調(diào)。免疫組化檢測組織中與增殖相關(guān)的Ki67、與EMT相關(guān)的VEGF和Vimentin的表達如圖6E所示，與miR-NC組比較，mimic組的Ki67(

t

=10.79,

P

<0.05)，VEGF(

t

=4.929,

P

<0.05)和Vimentin(

t

=4.548,

P

<0.05)表達下調(diào)。上述實驗均表明，miR-138-5p過表達抑制了模型小鼠體內(nèi)移植瘤的生長。

圖6 miR-138-5p的過表達對模型小鼠體內(nèi)移植瘤的影響

3 討論

葡萄膜黑色素瘤可以發(fā)生在眼葡萄膜的任何位置，包括虹膜、睫狀體和脈絡(luò)膜，其確診依據(jù)病理學檢查。按照WHO制定的統(tǒng)一組織學分類標準，可將葡萄膜黑色素瘤分為：梭型細胞型(A、B兩型)、上皮樣細胞型、混合細胞型和其它型。光學顯微鏡下觀察，梭型細胞A型的瘤細胞是長梭形，無核仁，細胞核小，無病理性核分裂像，形態(tài)似良性；梭型細胞B型瘤細胞是胖梭型，細胞核較大，有病理性核分裂像。上皮樣細胞型細胞更大，形態(tài)不規(guī)則，核仁明顯，細胞核大，病理性核分裂像多見。一般認為梭型細胞的比例愈高預(yù)后越好，而上皮樣細胞愈多預(yù)后愈差。

miR-138在多種癌癥中異常表達，具有影響癌細胞的增殖、凋亡等生物學功能。據(jù)報道，miR-138在結(jié)直腸癌中表達水平降低，抑制細胞增殖，其與患者惡性程度負相關(guān)，與生存正相關(guān)。也有研究顯示，miR-138在肺組織中的表達明顯降低，體外實驗表明miR-138能抑制肺癌細胞的增殖、侵襲和遷移。有研究表明，miR-138-5p靶向生存素抑制了膀胱癌細胞的增殖和侵襲特性，并且miR-138-5p在一種移植瘤小鼠模型中通過負向調(diào)節(jié)生存素發(fā)揮了抗腫瘤作用。Pang et al研究表明miR-138在胃癌組織和細胞中表達下調(diào)；在體外，過表達miR-138抑制胃癌細胞的增殖、克隆形成、遷移和侵襲；在體內(nèi)，過表達miR-138-5p抑制腫瘤生長。本研究提示miR-138-5p過表達抑制了MuM-2B細胞增殖，上調(diào)了E-cadherin的表達，上調(diào)N-cadherin和Vimentin的表達，減弱了細胞侵襲能力。以上研究表明，miR-138-5p的過表達能抑制眼葡萄膜黑色素瘤的增殖及EMT。

該研究中用生物信息學分析預(yù)測miR-138在葡萄膜黑色素瘤細胞中的可能靶基因為TCF4。TCF4是一種基本的螺旋環(huán)螺旋轉(zhuǎn)錄因子。大量研究表明，TCF4具有促進腫瘤生長的作用。TCF4高表達與肺癌進展呈正相關(guān)。Wang et al研究結(jié)果顯示，SPINDLIN1異位表達激活Wnt/TCF4信號通路，促進卵巢癌細胞增殖。Teng et al研究認為TCF4可激活驅(qū)動蛋白家族C1(kinesin family member C1，KIFC1)，從而促進肝細胞癌的EMT，增強了細胞侵襲和增殖。本研究表明，miR-138-5p與TCF4的表達呈負相關(guān)，并通過熒光報告基因?qū)嶒炞C實TCF4是miR-138-5p的潛在靶基因。TCF4過表達促進了MuM-2B細胞增殖和侵襲能力，并下調(diào)E-cadherin表達，上調(diào)N-cadherin和Vimentin表達，增強EMT。而過表達miR-138可逆轉(zhuǎn)上述結(jié)果。在進一步的裸鼠移植瘤實驗中，miR-138過表達下調(diào)了TCF4水平，抑制了增殖與侵襲相關(guān)蛋白Ki67、VEGF和Vimentin的表達，進而抑制腫瘤生長。以上研究表明， miR-138-5p通過靶向TCF4從而抑制眼葡萄膜黑色素瘤的增殖及EMT。