微透析法研究NG2細胞功能變化對大鼠中縫核興奮性和抑制性遞質含量的影響

楊 欣，全 睿，王 慧，郭海波，滕 柳

在發育和成熟的中樞神經系統中，存在大量表達硫酸軟骨素蛋白多糖的一類細胞，稱為NG2細胞，其抗原屬性、形態及功能等有別于其他的膠質細胞，被認為是第四類神經膠質細胞。研究表明NG2細胞在體內能夠產生少突膠質細胞，還能產生原漿性星形膠質細胞；在發育和成熟的中樞神經系統的多個區域，NG2細胞和神經元之間存在獨特的突觸聯系，可能與神經元形成一個獨特的神經膠質網絡。5-羥色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)是調節睡眠和覺醒的神經遞質，主要來源于中腦中縫核, 中縫核內富含5-HT神經元，同時中縫核內也存在著神經膠質細胞群。課題組前期研究顯示腦內的5-HT下降可激活中縫核星形膠質細胞，但NG2細胞功能變化對大鼠中縫核興奮性和抑制性遞質含量的影響尚不明確。因此，該研究采用微透析的方法，探討中縫核中5-HT與NG2細胞的相互作用對γ-氨基丁酸 (γ-aminobutyric acid,GABA)和谷氨酸 (glutamic acid,Glu) 遞質含量變化的影響。

1 材料與方法

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1 材料

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實驗動物 健康SD(Sprague- Dawley)大鼠70只，雄性，體質量220～250 g，由長沙市天勤生物技術有限公司提供，許可證號：SCXK (湘) 20180010。實驗動物飼養在避光、通風、電磁屏蔽狀態環境中，實驗溫度(22±2)℃，相對濕度45%～50%，飼料由長沙市天勤生物技術有限公司提供。

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實驗試劑 甲醇、乙腈(色譜純)購自德國默克公司；無水乙酸鈉、冰醋酸、四氫呋喃及其余試劑為國產分析純；Glu標準品(100 mg，純度≥99%)、GABA標準品(100 mg，純度≥98%)購自上海索萊寶生物科技有限公司。

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實驗儀器 液相色譜儀(型號：安捷倫1260)為安捷倫科技(杭州)有限公司產品；低溫高速離心機(型號：Eppendorf 5810R)為美國Thermo公司產品；電子天平(型號：Sartori-us BSA124S )為賽多利斯科學儀器(北京)有限公司產品；超聲波清洗器(型號：KQ5200E)為昆山市超聲儀器(昆山)有限公司產品；OLABO數顯三用恒溫水箱(型號：HH-W420)為鑫貝西生物技術(濟南)有限公司產品。

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2 實驗方法

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動物分組及給藥 健康雄性SD大鼠70只，隨機分為正常組、對照組、NG2抗體(NG2-Ab)組、對氯基丙氨酸(p-chlorophenylalanine，PCPA)組、5-羥色胺(5-HT)組、PCPA+NG2-Ab組和5-HT+NG2-Ab組。正常組不做任何處理；對照組中縫核微量注射2 μl 0.9%氯化鈉溶液；NG2-Ab組中縫核微量注射NG2-Ab(2 μg/μl)2 μl；PCPA組中縫核微量注射PCPA(5 μg/μl)2 μl；5-HT組中縫核微量注射5-HT(1.25 μg/μl)2 μl；PCPA+NG2-Ab組中縫核微量注射PCPA(10 μg/μl)1 μl+ NG2-Ab(2 μg/μl)1 μl。5-HT+NG2-Ab組中縫核微量注射5-HT(2.5 μg/μl)1 μl+NG2-Ab(2 μg/μl)1 μl。

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標準品及緩沖液配制 GABA、Glu標準儲備液的配制：準確稱取GABA、Glu標準對照品10.00 mg，配成100 mg/ml標準液，置于40 ℃冰箱保存。鄰苯二甲醛(O-Phthalaldehyde，OPA)柱前衍生: 稱取0.2 g OPA，溶解于10 ml甲醇(4 ℃保存)；配置衍生劑溶液[0.5 ml OPA+2 ml 0.2 mol/L四硼酸鈉緩沖液(PH=9.4)+30 μl β-巰基乙醇]，此衍生劑溶液可保持2 d。取樣品或標準品10 μl，加入上述溶液100 μl，混勻，反應1 min后通過0.22 μm濾膜過濾進樣。

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色譜分析條件 色譜柱Agilent ZORBAX SB-C18 (250 mm×4.6 mm，填料顆粒直徑5 μm)，流動相A為氫呋喃-甲醇-0.05 mol/L醋酸鈉(PH=6.2,5∶75∶420 V/V)，流動相B為甲醇，檢測波長254 nm，柱溫25 ℃，流速1.0 ml/min，進樣量10 μl。梯度洗脫程序：0～6 min，流動相B的體積分數為20%；6～20 min，流動相B的體積分數從20%升至50%；20～30 min，流動相B的體積分數從50%升至100%；30～40 min，流動相B的體積分數從100%降至20%。

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微透析實驗

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微透析管的埋置 動物用25%氨基甲酸乙酯(3 ml/kg)腹腔注射麻醉后，俯臥位固定于立體定位儀上。按照Paxinos和Watson大鼠腦立體定位圖譜確定中縫核位置(前囟后7.4 mm,旁開0 mm，深度6.4 mm)，用顱骨鉆鉆開一直徑為2 mm的顱窗，挑破硬腦膜，在立體定位儀引導下將微透析套管插入中縫核，牙科水泥固定，術后將實驗動物置于特定的環境中，單籠飼養，連續3 d腹腔注射4萬U青霉素，動物恢復5 d后用于實驗。實驗結束后微透析插管部位注入臺盼藍染色，切片，鏡下檢查插管位置，檢查結果表明插管位置均位于中縫核。

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微透析液的收集 實驗動物每日9 a.m.進行微透析液收集。將微透析探針插入預先埋置于中縫核的套管中，微透析管膜長1 mm，外徑為0.5 mm。用Ringer氏液以2 μl/min的速度灌流，每20 min收集1管透析液(40 μl)。微透析管置入60 min后正式收集微透析液，以取得穩定的基礎值。實驗給藥前分別收集20、40 min微透析液作為實驗對照，然后收集給藥后第20、40、60、80、100、120 min各時相點的微透析液，用于測定Glu、GABA的含量。樣本收集器的溫度設定為4 ℃。收集后的微透析液樣品置于-80 ℃冰箱保存。

2 結果

2.1 Glu和GABA標準工作曲線

分別吸取Glu和GABA濃度為0、0.625、1.25、2.5、5、10 μg/ml，加入衍生劑溶液100 μl。以峰面積為縱坐標，以相應的濃度為橫坐標得到回歸方程和相關系數。Glu：

Y

=2 086

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6

X

+741

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35，

r

=0.990 7；GABA：

Y

=3 040

X

-962

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05，

r

=0.990 1。

2.2 GABA、Glu定性結果

將GABA、Glu標準液在色譜儀上以10 μl進樣作色譜分析。在標準液的定性分析中，根據保留時間以及紫外譜圖判定該物質。定性結果見圖1A、B。Glu、GABA標準品的保留時間分別為2.186、3.437 min。

圖1 標準品色譜圖A：Glu標準品色譜圖；B：GABA標準品色譜圖

2.3 中縫核注射NG2抗體對GABA 和Glu含量變化的影響

與對照組相比，NG2-Ab組GABA含量在注射后第80 min 和第100 min時間段降低，Glu含量在注射后40 min降低，差異有統計學意義(

P

<0.05)(表1、2)。結果表明中縫核NG2-Ab能影響GABA和Glu含量。

2.4 中縫核注射PCPA對GABA和Glu含量變化的影響

與對照組相比，PCPA組第80 min、第100 min和第120 min GABA含量降低，Glu含量在注射后100 min和120 min升高，差異有統計學意義(

P

<0.05)。見表1、2。

2.5 中縫核注射5-HT對GABA和Glu含量變化的影響

與對照組相比：5-HT組GABA含量在注射后第40 min、第100 min和第120 min 升高，差異有統計學意義(

P

<0.05)；Glu含量在第20 min、第40 min降低，差異有統計學意義(

P

<0.05，

P

<0.01)。見表1、2。

表1 各組大鼠給藥前后中縫核GABA含量的變化

3 討論

NG2細胞廣泛分布于成熟的中樞神經系統的灰質及白質中，NG2細胞不能被其它類型的膠質細胞特異標志物所標記，如星形膠質細胞、成熟少突膠質細胞、小膠質細胞的特異性標記，也不被神經元的標志物MAP2所標記。因此，NG2細胞被認為是一種新的膠質細胞類型。NG2細胞具有高度分化潛能，主要分化成參與髓鞘形成的少突膠質細胞。NG2細胞能表達離子型Glu受體和GABA受體，還能與神經元形成興奮性和抑制性突觸聯系，在中樞神經系統信息傳遞中起到重要作用。

5-HT能神經元胞體主要集中在中縫核，發出上行纖維投射到大腦皮質、紋狀體、間腦、邊緣系統和小腦等腦區。中縫核群的5-HT能神經元投射到間腦和大腦皮質，主要形成慢波睡眠(SWS)，中縫核尾部的神經元則與腦橋背內側被蓋相聯系，負責觸發快波睡眠(FWS)。中縫核內的神經元包括5-HT能神經元和非5-HT能神經元，除神經元外，中縫核內還含有大量神經膠質細胞，它們能被外界刺激因素影響從而改變其組織形態，改變與神經元的信息交流和相互作用。

PCPA是色氨酸羥化酶不可逆抑制劑，可以有效阻止5-HT的合成，顯著降低腦內的5-HT濃度。為了進一步了解中縫核NG2細胞與5-HT的功能關系，本研究向中縫核內微量注射PCPA及5-HT,分別造成5-HT含量下降和5-HT含量升高，觀察GABA和Glu含量變化情況;同時注射NG2細胞抗體，觀察NG2細胞興奮性下降后5-HT含量下降或上升導致的GABA和Glu含量變化情況。研究顯示單獨給予PCPA造成5-HT含量下降后，能引起中縫核GABA含量下降、Glu含量上升；而同時給予PCPA和NG2細胞的抗體，中縫核GABA含量無明顯變化，而Glu含量則下降，表明NG2細胞興奮性被抑制后PCPA引起的GABA含量和Glu含量變化發生了改變，提示NG2細胞參與了5-HT含量下降導致的GABA和Glu含量的變化過程。中縫核單獨微量注射5-HT導致5-HT含量上升后，GABA含量上升，Glu含量下降；同時給予5-HT和NG2-Ab后，中縫核GABA含量無明顯變化，Glu含量下降；提示NG2細胞參與了5-HT上升引起的GABA含量變化。

表2 各組大鼠給藥前后中縫核Glu含量的變化

研究顯示NG2細胞與缺血、低氧、外傷、炎癥及毒性物質作用等諸多神經系統疾病有關，NG2細胞是對中樞神經系統有害刺激迅速作出反應的細胞類型之一，其反應往往比神經元發生早，甚至早于其它神經膠質細胞，這些研究說明NG2細胞在神經病理學中發揮積極作用；NG2細胞可能與神經元構成一個獨特的神經元—膠質聯系網絡，參與中樞神經系統多種生理和病理過程，極有可能成為中樞神經系統某些疾病治療的靶點。本研究表明NG2細胞可以調節中縫核GABA和Glu含量，同時參與5-HT含量變化引起的GABA和Glu含量變化的調控。GABA和Glu是腦內重要的抑制性遞質和興奮性遞質，在皮質興奮和抑制調節機制中起著重要作用，但NG2通過何種途徑調控GABA和Glu的含量，還需進一步研究。正常的睡眠覺醒功能依賴于皮層興奮和抑制的動態平衡，中樞5-HT可能通過改變Glu能和GABA能神經元的興奮性，調節神經遞質釋放量，調控大腦皮質興奮和抑制過程，NG2細胞在其中發揮了重要的作用。該研究為睡眠調節藥物的研發提供了實驗依據。