高原低氧環境下心臟功能改變及其與自噬蛋白活化的關系

孫海霞，李 方，蘇玉鑫，曹 寧

高原低氧環境(high altitude hypoxia，HAH)對長期生活在該地區的人類的健康構成了潛在威脅。由于空氣中氧分壓較低，易誘發多種心血管疾病，如高血壓、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病。盡管這些心血管疾病的病因可能涉及內質網應激、氧化應激和全身炎癥，但確切的機制尚不清楚。自噬是一個重要的自我更新過程，其中細胞內容物被降解和再循環，以維持細胞內穩態。最近的研究表明自噬比細胞死亡機制更能促進細胞生存。自噬在心臟中是高度動態的，其基礎水平在維持心肌細胞動態平衡中發揮重要作用。自噬的實質性上調可以保護心肌免受多種病理因素的影響，如缺血再灌注和超負荷。相反，自噬功能受損會干擾能量和蛋白質代謝，并導致心肌病，如心力衰竭或心肌纖維化。然而，尚不清楚自噬在HAH下心臟病理中的動態變化和功能作用。研究表明，單磷酸腺苷激活的蛋白激酶(adenosine-5′-monophosphate activated protein kinase，AMPK)是心臟自噬的關鍵介質，而降低AMPK介導的自噬會誘發心肌纖維化。該研究評估大鼠長期暴露于HAH對心臟功能的影響，并探討其作用機制是否與AMPK途徑介導的心肌纖維化進程中自噬活性有關。

1 材料與方法

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1 實驗動物及分組

80只雄性Sprague Dawley大鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證編號：SCXK(京)2016-0006。所有大鼠均為8周齡，體質量200～220 g。將大鼠飼養在標準動物房中，12 h/12 h明暗循環，并自由獲得食物和水。環境溫度在18～22 ℃，濕度為55%。實驗分為2個階段，第一階段考察HAH對大鼠心臟功能和心臟自噬蛋白表達的影響。大鼠被安置在4 500 m海拔高度(青海省洛州瑪多縣)，分別在飼養第0、1、2、4、8周隨機選取10只大鼠進行體質量、血壓和超聲心動圖檢查，然后處死大鼠，完整摘取心臟，并將其保存在-80 ℃下用于自噬蛋白檢查。第二階段考察自噬誘導劑雷帕霉素對HAH環境下大鼠的心臟保護作用。30只大鼠隨機分為2組，每組15只動物，包括對照組和雷帕霉素組。雷帕霉素組每天定時通過腹腔注射雷帕霉素(美國Sigma-Aldrich公司)1 mg/kg，連續治療8周。對照組腹腔注射相同體積的0.9%氯化鈉溶液。分別在試驗前和第8周試驗結束時進行體質量、血壓和超聲心動圖檢查，然后處死大鼠，完整摘取心臟，進行組織學和自噬蛋白檢查。

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2 血壓記錄

使用尾袖法測量清醒狀態下大鼠的血壓(收縮壓)。在用尾袖法記錄血壓之前，將動物限制在試管中10～20 min/d，持續5 d，以更好地檢測尾動脈脈搏，使尾巴穿過袖帶和連接至放大器的NIBP尾袖帶傳感器(澳大利亞AD Instruments公司)，記錄充氣和放氣期間的脈沖。

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3 超聲心動圖檢查

在用乙醚麻醉動物后，使用Vevo 2100超聲儀(加拿大VisualSonics公司)進行超聲心動圖檢查，記錄右室舒張末內徑(right ventricular end diastolic dimension，RVEDd)、左室舒張末內徑(left ventricular end-diastolic dimension，LVEDd)、肺動脈加速時間(pulmonary artery acceleration time，PAAT)、舒張室間隔厚度(interventricular septum thickness at end-diastole，IVSd)、左室舒張后壁厚度(left ventricular posterior walldepth，LVPWd)及左室射血分數(Left ventricular ejection fraction，LVEF)。

1.4 蘇木精-伊紅(HE)染色和Masson三色染色

對心臟組織進行常規固定和處理，獲得4 μm石蠟包埋切片，用HE和Masson三色染色進行評估。心肌的組織病理學損傷評分參照Kanda et al報道方法，評分標準如下：0分，正常；1分，輕度；2分，中度；3分，重度；4分，非常嚴重。

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5 免疫組化

對各組大鼠的心臟進行免疫組化分析。組織切片經脫蠟、再水化為pH 6.0的枸櫞酸鈉緩沖液預處理以獲得抗原。將切片在4 ℃的加濕培養箱中孵育2 h，加入兔多克隆抗I型膠原(Col I)(1 ∶50，英國Abcam公司)和單克隆抗α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)抗體(1 ∶25，英國Abcam公司)4 ℃下培養、過夜。然后在室溫下用二級抗體(美國Santa Cruz公司)染色1 h。使用CX31顯微鏡(日本Olympus公司)進行檢查。

1.6 TUNEL分析

將心肌組織切成2 mm厚的切片，常規石蠟包埋，切片成5 μm厚的切片。用TUNEL試劑盒(瑞士Roche Applied Science公司)檢測細胞凋亡。

1.7 Western blot分析

將心臟組織在冰冷的RIPA裂解液中超聲裂解。將細胞裂解物在4 ℃下以10 000 r/min離心30 min。然后通過BCA法(美國Thermo Fisher Scientific公司)測定蛋白質濃度。在10%SDS-PAGE凝膠上分離等量的蛋白質(50 μg)，并轉移到PVDF膜上。使用抗微管相關蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)、自噬基因(Beclin-1)、p-AMPK(美國Bioworld Technology公司)和β-actin(武漢Boster公司)孵育過夜。在室溫下用適當的辣根過氧化物酶偶聯的二抗(1 ∶3 000，美國Santa Cruz Biotechnology公司)孵育2 h。最后，使用增強化學發光試劑盒(美國Thermo Scientific公司)觀察印跡。

2 結果

2.1 HAH環境暴露對大鼠體質量、血壓和心臟功能的影響

大鼠的收縮壓、體質量、RVEDd、LVEF隨著HAH環境暴露時間的增加而增加(

P

<0.05)，PAAT則降低(

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<0.05)。見表1。

表1 HAH暴露對大鼠體質量、血壓和心臟功能的影響

2.2 HAH環境暴露對大鼠心臟組織病理學影響

不同HAH環境暴露時間，心臟的組織病理學改變及其損傷評分見圖1。HE染色顯示，隨著HAH環境暴露時間的不斷延長，大鼠出現心肌變性、壞死和纖維化，伴有單核細胞浸潤(圖1B)，并且在Masson三色染色中，大鼠心臟心肌纖維化面積逐漸增加(圖1C)。

圖1 HAH環境暴露對大鼠心臟組織病理學影響

2.3 HAH環境暴露對大鼠心臟自噬蛋白影響

心臟組織中檢測到Beclin-1、LC3-Ⅱ/Ⅰ和AMPK的蛋白表達呈拋物線波動。心臟組織自噬相關蛋白在第4周增加，并達到峰值水平，但在第8周后受損(圖2)。

2.4 雷帕霉素對HAH環境暴露下大鼠的心臟保護作用

通過測定雷帕霉素存在和不存在時心肌纖維化的多項指標，評價了自噬在HAH誘導的心肌纖維化中的作用。與對照組相比，雷帕霉素組SBP、RVEDd、LVEF降低(

P

<0.05)，PAAT則升高(

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<0.05)(表2)。與對照組相比，雷帕霉素組自噬相關標記物Beclin-1、LC3-Ⅱ/Ⅰ和AMPK蛋白表達升高(

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<0.01)(圖3A)。HE和Masson三色染色顯示，雷帕霉素組大鼠出現心肌變性、壞死、纖維化和伴有單核細胞浸潤減少(圖3B)。雷帕霉素組中凋亡細胞核的百分比降低(

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<0.01)(圖3C)。IHC圖像顯示雷帕霉素組中Col I、α-SMA的陽性染色較對照組減少(

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<0.01)(圖3D)。

圖2 HAH環境暴露對大鼠心臟自噬影響

表2 雷帕霉素對HAH環境暴露下大鼠體質量、血壓和心臟功能的影響

圖3 雷帕霉素對HAH環境暴露下大鼠的心臟保護作用

3 討論

最近的研究表明，HAH暴露引起的血管張力增加可能導致肺血管重塑、心室重構和右心衰竭。其中，心室重構的特點是細胞外基質改變，包括Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原，被認為是參與心肌纖維化的主要因素。因此，HAH暴露可誘發心血管疾病。本研究顯示，暴露在HAH環境下大鼠的高血壓和心肌功能障礙的發展有時間依賴性特點。以前的研究表明HAH誘導的高血壓至少需要3周，本研究顯示，在HAH暴露早期(2周)大鼠SBP升高程度較高，并在第4周后維持在一個相對穩定的水平，但仍高于0周水平。SBP升高可能反映了適應機制，包括壓力感受器適應、副交感神經上調和一氧化氮合成增加。超聲心動圖評估顯示，RVEDd隨著時間的變化而增加。增加的RVEDd / LVEDd比值與肺動脈高壓的嚴重程度相關。此外，暴露于HAH后，大鼠LVEF增加，這與之前的研究中描述的結果一致。上述結果提示，長期HAH暴露可導致心臟功能嚴重改變。

近年來，自噬已被證明是參與生理和病理性心肌纖維化的一個關鍵因素。心臟自噬是一個高度保守和動態的生理過程。以前的研究在急性心肌梗死模型中觀察到心肌自噬在急性期誘導亞急性期和慢性期受損；而通過使用雷帕霉素增強自噬作用，可拮抗急性心肌梗死誘導的心肌纖維化。另一項關于急性心肌梗死期間心臟自噬的研究提示，急性心肌梗后早期遠端心肌的LC3持續增加，而梗死后較長時間后LC3下降。本研究探討了長期HAH后心臟自噬的動力學變化及功能作用。自噬相關蛋白的生化檢測結果表明，在HAH暴露期間，自噬在最初的代償性增加后減少并維持在一個較低的水平，與Wu et al研究中描述的趨勢相似。

基礎條件下的自噬水平是維持心肌結構和功能的重要穩態機制。研究表明，自噬的上調可以保護心肌免受各種病理刺激，如缺血再灌注、過載。然而，受損的自噬不足以處理這些病理因素，導致胞質蛋白更新減少和蛋白質聚集體積聚從而誘發心肌病。在本研究中，通過測量心肌纖維化的幾個指標，檢測到HAH下心肌纖維化的改變和自噬受損的功能障礙。為了探討在長時間HAH暴露過程中自噬受損的意義，用雷帕霉素治療大鼠來上調這一過程。結果表明，雷帕霉素能恢復心肌自噬功能，逆轉HAH誘導的心肌纖維化和功能障礙。因此，HAH損傷了心肌自噬功能，而自噬是HAH誘導心肌纖維化的必要條件。

AMPK作為一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，在心臟中高度表達，并對心臟自噬至關重要。研究表明上調AMPK能誘導自噬的發生，并保護心肌細胞免受各種病理因素的影響，如缺血和梗死。此外，AMPK缺乏會干擾自噬體的形成，從而降低心臟功能并導致心肌纖維化。AMPK失活限制了氧化應激下心肌細胞的保護性自噬機制。本研究顯示在HAH暴露過程中AMPK表現出與自噬相關蛋白相似的時間變化過程，并且雷帕霉素治療上調了AMPK表達。這些結果表明HAH下心肌細胞自噬與AMPK的調控有關，然而具體的調控機制有待于進一步研究。

綜上所述，長期暴露于HAH環境破壞大鼠心臟功能，其作用機制與AMPK途徑介導的心肌纖維化進程中自噬活性有關。