裸鼠異種移植急性T淋巴細胞白血病模型的建立

張愛君，潘文文，胡曉曦，吳育晶，魏 偉

急性T淋巴細胞白血病(acute T-cell lymphoblastic leukemia, T-ALL)是一種來源于骨髓的侵襲性惡性腫瘤。近年來，我國T-ALL發病率呈升高趨勢，部分患者出現耐藥和復發等現象導致預后不佳，因此T-ALL的相關病理機制和藥理學研究有著重要意義。目前對T-ALL疾病發病機制的認識很大程度上來源于對人體以及原代人T-ALL細胞的體外研究，在研發治療T-ALL新藥的藥理學研究中，實驗動物模型的選擇和建立至關重要。目前的白血病動物模型包括異種移植性白血病、自發性白血病、誘發性白血病和轉基因動物模型，其中異種移植性白血病模型較為常用，多選用BALB/c 裸鼠造模。T-ALL動物模型的建立除了動物種類，移植途徑的選擇也很重要。因此，為了建立操作簡便、經濟可靠、重復性好和觀察指標明確的T-ALL模型，該文將通過比較尾靜脈移植和皮下移植人Jurkat細胞建立異種移植T-ALL裸鼠動物模型的優缺點，為研究T-ALL的發病機制以及相關新藥的研發奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 主要藥物、試劑與儀器

環磷酰胺粉針劑(CTX，0.2 g/支)購自安徽醫科大學第一附屬醫院；BV421抗人CD3抗體購自美國BioLegend公司；CD3抗體購自美國Santa Cruz公司；Triton X-100購自上海碧云天公司；EDTA抗原修復液、HO、DAB購自北京中杉金橋生物技術有限公司；儀器Olympus顯微成像系統購自日本Olympus公司；CytoFLEX型流式細胞儀購自美國貝克曼公司；人白介素-2(interleukin-2, IL-2)ELISA試劑盒購自南京優宜佳生物科技有限公司；Tecan Infinite M1000酶標儀購自瑞士TECAN公司。

1.2 細胞來源與培養

人Jurkat細胞株購于美國ATCC細胞庫，將Jurkat細胞置于10%滅活胎牛血清、1%雙抗的RPMI 1640培養液中，然后放入37 ℃、5% CO恒溫培養箱中培養。

1.3 實驗動物

40只雌性BALB/c裸鼠，5周齡，體質量17～20 g，購自江蘇集萃藥康生物科技有限公司[SPF級，合格證號：SCXK(蘇)2018-0008]。

1.4 T-ALL白血病細胞移植

將40只裸鼠隨機分為正常組(

n

=10)、尾靜脈移植組 (

n

=15)和皮下移植組(

n

=15)。粉針劑環磷酰胺用滅菌0.9 %氯化鈉溶液稀釋成濃度為20 mg/ml的溶液，腹腔注射CTX 2 mg/只，連續注射2 d；第3天收集處于對數生長的Jurkat細胞，調整細胞密度至2.5×10個/ml。尾靜脈移植組裸鼠，尾靜脈緩慢注射無菌Jurkat細胞5×10個/只(0.2 ml)，連續注射2 d；皮下移植組裸鼠，于裸鼠頸背皮下注射無菌Jurkat細胞5×10個/只(0.2 ml)，連續注射2 d。

1.5 動物飼養

所有裸鼠飼養在層流架上無菌獨立送風隔離IVC籠中, 與其接觸的物品、飼料和飲用水均須滅菌處理。SPF條件下飼養1周后正常組裸鼠尾靜脈注射0.2 ml無菌PBS，其余兩組分別采取尾靜脈移植和皮下移植進行細胞移植。

1.6 觀察記錄

每天觀察裸鼠進食、行動、弓背及精神情況；每周記錄1次體質量。裸鼠出現明顯消瘦、弓背、精神萎靡、體質量下降20%時視作瀕死狀態。

1.7 標本采集及處理

分別在造模第7天和第14天時裸鼠尾部取血20 μl，進行流式細胞術檢測并挑選出造模成功裸鼠。造模第28天裸鼠出現明顯消瘦、弓背、體質量下降超過20%，眼球取血后頸椎脫臼法處死并取出裸鼠肝、脾組織，取部分脾臟輕輕研磨，制成單細胞懸液用于流式細胞術檢測，剩余組織置于4%的多聚甲醛中常溫保存。

1.8 流式細胞術檢測裸鼠外周血、脾臟和骨髓中Jurkat細胞

分別將第7天和第14天時取的20 μl外周血，用紅細胞裂解液完全裂解后離心得細胞沉淀，然后向細胞沉淀中加入50 μl PBS重懸混勻，加入檢測所需抗人CD3流式抗體，混勻后4 ℃避光孵育30 min。清洗1次后流式細胞儀上機檢測Jurkat細胞在裸鼠外周血中的百分比。以裸鼠外周血中有Jurkat細胞表達為造模成功。根據Jurkat陽性裸鼠數量計算造模成功率，挑出造模成功裸鼠進行后續實驗。

第28天頸椎脫臼處死裸鼠后，取出脾臟充分研磨，獲取的脾臟細胞用50 μl PBS重懸混勻，同法加入抗體孵育后用流式細胞儀檢測。取得的骨髓細胞用50 μl PBS重懸混勻，同法加入抗體孵育后流式細胞儀檢測。通過檢測各組裸鼠脾臟和骨髓細胞中人CD3細胞百分比，反映裸鼠脾臟和骨髓細胞中Jurkat細胞浸潤情況。

1.9 外周血和骨髓瑞氏-吉姆薩染色

取第28天裸鼠新鮮的抗凝全血1滴(約5 μl)，置于干凈載玻片的一端1 cm處，左手持載玻片，右手持推片從血滴前方后移接觸血滴，使血滴沿推片后緣展開，推片與載玻片以30°～45°、勻速、平穩地向前移動推制成血涂片，滴加瑞氏-吉姆薩染液，染色1 min，再將磷酸鹽緩沖液滴加于瑞氏-吉姆薩染液上，以洗耳球吹出微風使液面產生漣漪狀，使兩液充分混合，染色3～10 min，流水沖洗，待干，鏡檢。剪掉裸鼠大腿上的皮膚和肌肉，暴露股骨及兩端相連的關節，然后從股骨兩端關節頭處取下股骨，剪斷股骨一端，用抽有0.9%氯化鈉溶液的1 ml注射器插入骨髓腔深處，將沖出的骨髓液用200目紗網過濾，PBS溶液沖洗1遍后，取10 μl左右進行瑞氏-吉姆薩染色，在光學顯微鏡下計數200個有核細胞，計算其中Jurkat細胞所占比例(%)。

1.10 裸鼠肝脾病理學和免疫組化學分析

取4 %的多聚甲醛固定48 h后的組織樣本，石蠟包埋、切4 μm組織切片。取正常裸鼠對應組織用于組織病理學等對照。采用蘇木精-伊紅染色法對所取組織進行染色，光學顯微鏡觀察組織病理學變并拍照，檢測Jurkat腫瘤細胞株在肝臟和脾臟組織中的浸潤情況及病理改變。

1.11 裸鼠肝脾組織免疫組織化學染色

各組裸鼠肝脾組織的石蠟切片經60 ℃恒溫箱烘烤2 h，經脫蠟和水化后用抗原修復液熱修復15 min，冷卻后用山羊血清封閉20 min，加入抗人CD3一抗(1 ∶50)，4 ℃孵育過夜。第2天取出復溫，洗滌后加入二抗37 ℃孵育20 min，PBS洗滌3次滴加DAB顯色，選取適當時候終止反應。蘇木精染色10～30 s后用蒸餾水沖洗后再經脫水、晾干后，中性樹脂封片。最后光學顯微鏡下觀察Jurkat細胞浸潤情況。細胞染色呈棕黃色為陽性。

1.12 ELISA檢測血清IL-2表達水平

按照人IL-2細胞因子ELISA檢測試劑盒說明書操作，檢測裸鼠血清中IL-2濃度，反映浸潤Jurkat細胞分泌炎性細胞因子功能。將標準品倍比稀釋，檢測時分別設待測樣品孔和空白孔(空白孔不加樣品及酶標試劑，其余步驟相同)，每孔加入100 μl標準品或樣品，37 ℃孵育90 min，洗板4次，盡量甩干洗液。每孔再加入100 μl生物素化抗體工作液，封口37 ℃孵育60 min，再次洗板后加入100 μl酶結合物工作液，封口，37 ℃孵育30 min，洗板，加入100 μl顯色劑，37 ℃孵育10～20 min加入100 μl終止液用酶標儀立即讀取450 nm吸光度值，最后根據標準曲線計算裸鼠血清中IL-2濃度。

1.13 統計學處理

SPSS 24.0和GraphPad Prism8軟件對結果進行統計學分析。數據用%表示，兩組間比較采用

t

檢驗，多組間差異的比較采用單因素方差分析(ANOVA)。

P

<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 整體觀察結果

尾靜脈移植組和皮下移植組至第7天未出現明顯變化，于第14天開始表現出嗜睡、飲食欠佳等狀態，于第21天尾靜脈移植組和皮下移植組出現弓背、消瘦、活力減低和明顯萎靡不振等現象(圖1)，于第28天則有部分裸鼠出現瀕死狀態，伴有脊柱彎曲。正常對照組裸鼠正常生長，活潑好動，食欲精神良好，未出現病態體征。

圖1 第21天T-ALL裸鼠整體狀態1：正常組；2：尾靜脈移植組；3：皮下移植組

2.2 指標檢測

2

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2

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1

外周血、骨髓和脾臟流式檢測結果 正常組BALB/c裸鼠無胸腺，為先天性T細胞免疫缺陷，人Jurkat細胞表面特異性標志物為CD3，通過流式細胞術檢測人CD3細胞的百分比可以反映移植入BALB/c裸鼠體內的Jurkat細胞的百分比。第7天和第14天外周血流式細胞術檢測結果顯示Jurkat細胞在造模第7天時已經在外周血中浸潤，其中尾靜脈移植組裸鼠外周血中Jurkat細胞百分比平均為7.24%，皮下移植組平均為4.30%。第14天外周血中Jurkat細胞百分比，尾靜脈移植組(16.16%±3.30)高于皮下移植組(8.14%±1.05)(

t

=5.241,

P

<0.01，圖2)。第28天裸鼠脾臟細胞流式細胞術檢測結果顯示：尾靜脈移植組和皮下移植組裸鼠脾臟中均有Jurkat細胞表達，且尾靜脈移植組(7.31% ± 2.30%)Jurkat細胞百分比高于皮下移植組(3.60%±1.95%)(

t

=3.838,

P

<0.01)；骨髓細胞檢查結果與脾臟一致，尾靜脈移植組和皮下移植組裸鼠骨髓中均有Jurkat細胞表達，尾靜脈移植組(3.95% ± 2.95%)Jurkat細胞百分比高于皮下移植組(1.90%±1.35%)，差異有統計學意義(

t

=2.846,

P

<0.05)(圖3)。尾靜脈移植組成模率為73%，皮下移植組成模率為40%。

圖2 流式細胞術檢測第7天和第14天Jurkat細胞在裸鼠外周血中百分比

圖3 流式細胞術檢測脾臟和骨髓中Jurkat細胞百分比

2

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2

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2

體質量檢測結果 細胞移植后每周記錄各組裸鼠體質量變化，并繪制體質量變化曲線(圖4)。與正常組相比，尾靜脈移植組和皮下移植組體質量在第7天開始出現緩慢下降，并在第21天出現統計學差異(

F

=20.211，

P

<0.05)。尾靜脈移植組和皮下移植組之間差異無統計學意義。

圖4 裸鼠體質量變化曲線

2

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2

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3

外周血瑞氏

-

吉姆薩染色情況 建模第28天，裸鼠處死后取外周血涂片進行瑞氏-吉姆薩染色，尾靜脈移植組和皮下移植組裸鼠外周血中均可見Jurkat細胞，尾靜脈移植組比例平均為9.11%，皮下移植組比例最高可達6.37%；尾靜脈移植組和皮下移植組鏡下Jurkat細胞胞體偏大，呈圓形，胞漿量豐富，染藍色，胞核較大。正常組外周血中未見Jurkat細胞，以紅細胞為主，有核細胞少見。見圖5。

2

.

2

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4

骨髓瑞氏

-

吉姆薩染色結果 尾靜脈移植組和皮下移植組裸鼠處死后骨髓瑞氏-吉姆薩染色均可見Jurkat細胞，尾靜脈移植組比例平均可達12%，皮下移植組比例平均為8%，胞體偏大，呈圓形，胞漿豐富。胞核圓形，只有一個明顯的核仁。見圖6。

圖5 T-ALL裸鼠外周血Jurkat細胞浸潤 瑞氏-吉姆薩染色×400A：正常組；B：尾靜脈移植組；C：皮下移植組

圖6 T-ALL裸鼠骨髓Jurkat細胞浸潤 瑞氏-吉姆薩染色×400A：正常組；B：尾靜脈移植組；C：皮下移植組

2

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2

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5

病理組織學檢查 裸鼠脾組織病理切片常規HE染色結果顯示：正常組裸鼠脾組織結構完整，紅髓和白髓界限明顯；而尾靜脈移植組和皮下移植組裸鼠脾組織紅髓和白髓增生，界限模糊，并且出現Jurkat細胞浸潤現象，呈彌漫性生長。肝臟組織HE染色結果顯示：正常組裸鼠肝組織結構完整，肝細胞以中央靜脈為中心向周圍呈放射狀排列，無組織病理學變化；移植了Jurkat細胞的裸鼠肝組織切片可見Jurkat腫瘤細胞浸潤，尾靜脈移植組裸鼠中Jurkat細胞浸潤，且病變程度比皮下移植組裸鼠嚴重；尾靜脈移植組和皮下移植組裸鼠肝臟均出現部分肝組織壞死，正常肝組織結構被破壞。見圖7。

圖7 T-ALL裸鼠脾臟和肝臟病理檢查結果 HE染色

2

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2

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6

免疫組織化學法檢測CD3的表達 CD3分子在Jurkat細胞表面廣泛表達，采用免疫組織化學法檢測肝脾組織中Jurkat腫瘤細胞侵襲情況。正常組裸鼠肝脾組織經免疫組織化學染色均無棕黃色陽性反應，尾靜脈移植組和皮下移植組的肝脾組織則均有陽性反應，并且尾靜脈移植組的陽性面積比皮下移植組要高。尾靜脈移植組局部可見陽性細胞聚集。見圖8。

圖8 裸鼠肝脾組織中CD3蛋白的表達 免疫組化法染色 ×100

2

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2

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7

ELISA檢測血漿IL-2表達 正常對照組裸鼠血清中無IL-2表達，尾靜脈移植組和皮下移植組裸鼠外周血血清中有Jurkat細胞分泌的IL-2表達，其中尾靜脈移植組裸鼠血清IL-2水平高于皮下移植組，差異有統計學意義(

t

=4.085，

P

<0.001)(圖9)。

圖9 各組裸鼠血清中IL-2水平

3 討論

選擇和建立合理的動物模型是探究T-ALL的病理機制及開發創新藥物成功與否的關鍵。已有的動物實驗模型包括異種移植性白血病、自發性白血病、誘發性白血病和轉基因動物模型，可一定程度反映T-ALL的病理過程。其中異種移植性動物模型接種人T-ALL細胞更貼近臨床T-ALL疾病，是目前較為常用的一種白血病動物模型。

異種移植性動物模型的建立需要考慮多種因素，包括免疫缺陷小鼠、免疫抑制劑和移植途徑。免疫缺陷小鼠天生T、B淋巴細胞或NK細胞缺乏，對植入的腫瘤細胞排異反應較小，故成為研究血液學疾病的有力工具。免疫缺陷小鼠包括裸鼠、SCID、NOD/SCID和NSG，其中利用無胸腺免疫缺陷裸鼠是構建T-ALL動物模型中較為常用、經濟和易獲得的模型動物。裸鼠天生T細胞缺陷、為直接觀察和腫瘤的可視化提供了極好的機會，但成年裸鼠(6～8周齡)具有較高的自然殺傷細胞活性，使得體內建立全身白血病模型存在一定難度，需要通過脾臟切除術、全身輻照或使用免疫抑制劑等方法來進一步抑制其免疫功能。脾臟切除術對裸鼠會造成較大的生理性傷害，不符合動物福利要求。全身輻照雖然有較高的造模成功率，但對實驗室條件要求較高。免疫抑制劑就相對簡單安全，且可操作性更強。免疫抑制劑常用的有環磷酰胺和白消安。移植途徑的選擇至關重要，常用的細胞移植方式有皮下移植和尾靜脈移植，皮下移植即可用于實體瘤造模，也可用于白血病模型；尾靜脈移植常用于白血病模型，因此，本文旨在通過比較兩種移植方式的優缺點，建立操作簡便、經濟可靠、重復性好和觀察指標明確的T-ALL模型建立方法。

本實驗中尾靜脈移植組和皮下移植組裸鼠均出現白血病表現，體質量呈現“增長-緩慢下降-明顯下降”的變化趨勢，第14天體質量出現減輕，并持續下降，伴隨出現弓背、皮膚皺褶和精神萎靡等現象。本文利用流式細胞術動態監測裸鼠外周血中Jurkat細胞浸潤變化情況：第7天，裸鼠外周血中已有Jurkat細胞浸潤，且隨病程逐漸升高；第14天，尾靜脈移植組比皮下移植組Jurkat細胞浸潤更顯著；第28天，尾靜脈移植組和皮下移植組裸鼠外周血、骨髓、脾臟和肝均有不同程度的Jurkat細胞浸潤，肝脾組織已發生病理改變。通過裸鼠活體尾靜脈取血并動態監測Jurkat細胞浸潤變化是鑒定模型成功及確定給藥時間的重要手段。傳統的瑞氏-吉姆薩染色工作量大、主觀性強、對樣本要求高，本文采用流式細胞術檢測Jurkat表面標志CD3，操作方便、檢測準確，可作為瑞氏-吉姆薩染色的輔助觀察指標。

本文比較了兩種移植方式。皮下移植雖然操作簡便，但是在T-ALL造模過程中不易觀察到瘤體，成模率和細胞浸潤率也較低；尾靜脈注射移植方式具有成模率高、腫瘤細胞浸潤快、浸潤細胞多、更貼近臨床T-ALL的轉移特征等優點。因此，后者可作為異種移植T-ALL模型較理想的移植方式。

該文中建立的裸鼠尾靜脈異種移植T-ALL模型相對于皮下移植方式是一種操作簡便、經濟可靠、重復性好和觀察指標明確的T-ALL模型建立的方法，可為研究T-ALL的發病機制及其相關新藥的研發提供實驗基礎，也為T淋巴細胞白血病、淋巴瘤等血液系統疾病的基礎研究奠定動物實驗基礎。