基于轉錄組測序的ATPR誘導NB4細胞分化過程中lncRNA的初步鑒定與分析

馮鈺斌，胡 爽，李蘭蘭，徐小玲，張梅菊，彭曉清，陳飛虎

急性早幼粒細胞白血病 ( acute promyelocytic leukemia,APL) 屬于急性髓系白血病 (acute myeloid leukemia,AML) 的M3分型，臨床上主要采用誘導分化治療，全反式維甲酸(all trans retinoic acid,ATRA)是臨床治療的首選藥物，但維甲酸綜合征、耐藥性等都是其副作用。為了避免這些副作用，課題組前期對ATRA進行結構改造，得到了很多ATRA衍生物，經過前期的藥效學篩選，發現4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯 (4-amino-2-trifluoromethyl-phenyl retinate,ATPR)具有較強的抗腫瘤活性。

長鏈非編碼RNA (long-chain non-coding RNA，lncRNA)主要是通過順式或反式作用調節來發揮基因表達的作用。lncRNA不僅可以調節上皮間質轉化過程，還可以充當 microRNA 海綿來調節信號通路。lncRNA 比 mRNA 的特異性更高，所以lncRNA更有可能被開發成腫瘤診斷和預后的標志物。該研究以NB4細胞為研究對象，運用基因芯片技術篩選出ATPR與ATRA分別作用于NB4細胞后差異表達的lncRNA和mRNA，以此探討ATPR 對 NB4 細胞作用的可能機制及分子靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

委托合肥新星藥業有限公司合成純度達到99.66%的ATPR(圖1)，用無水乙醇將其溶解成濃度為20 mmol/L 的母液，-20 ℃ 避光保存備用；陽性藥ATRA購自美國Sigma公司；NB4細胞株購自中科院上海細胞庫；RPMI 1640購自Hyclone 公司；小牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司。

圖1 ATPR分子式

1.2 細胞培養與加藥處理

為了得到對數生長期的細胞，在溫度為37 ℃、CO濃度為5%的培養箱中培養細胞，待滿足生長條件后，隨機將細胞分為兩組，用終濃度為1×10mol/L的ATRA和ATPR 分別處理細胞，培養72 h后收集細胞。

1.3 lncRNA和mRNA基因芯片表達譜

委托上海歐易生物科技有限公司代為完成基因芯片表達譜的構建與分析。具體方法參考文獻。

1.4 統計學處理

采用 Feature Extraction 軟件處理原始圖像，提取原始數據。采用Genespring軟件進行quantile標準化和后續處理。標準化后的數據進行過濾，用于比較的每組樣本中至少有一組100%標記為 “

P

” 的探針留下進行后續分析。利用

t

檢驗的

P

值和倍數變化值(Fold change,FC)進行差異mRNA和差異lncRNA篩選，篩選的標準為上調或者下調FC≥2.0且

P

≤0.05。對差異lncRNA進行GO和KEGG富集分析，以判定差異lncRNA主要影響的生物學功能或者信號通路。最后，對差異mRNA和差異lncRNA進行非監督層次聚類，利用熱圖和火山圖的形式展示差異基因在不同樣本間的表達模式。

2 結果

2.1 兩組lncRNA和mRNA的表達分析

與ATRA 組比較，利用基因芯片在ATPR組篩選出很多差異表達的lncRNA(FC>2，

P

<0.05)，在這些差異表達的lncRNA中，有511個是上調的，其余264個是下調的。緊接著對差異表達的標準化數據進行分析，制成火山圖 (圖2A) 和熱圖 (圖2C)。篩選出的排名前10的上調和前10的下調的lncRNA已經列出，見表1。結果顯示，在所有上調的lncRNA轉錄物中， lnc-COPS4的上調倍數最大，FC 達到了32.88，而lnc-ZNF569的下調倍數最大，FC達到了-9.65。依據相同的篩選標準 (FC>2，

P

<0.05)，有904個異常表達的mRNA轉錄本被發現，其中上調的有724 個，下調的有180 個 (圖 2B、D)。上調倍數最多和下調倍數最多的mRNA轉錄物分別是SDC2和 ARG1，FC達到了24.89和-13.26。

圖2 兩組差異表達的lncRNA和mRNA的火山圖和熱圖分析

表1 基因芯片結果中上調和下調前10位lncRNA

2.2 差異表達的lncRNA 的功能分析

為了研究差異表達lncRNA的功能，我們采用GO分析和KEGG通路注釋對前200個差異表達lncRNA的功能進行預測分析。GO分子功能分析結果顯示，排名前列的涉及一些發病機制的功能途徑，如 poly (A) RNA binding、receptor activity、protein binding、MAP kinase tyrosine phosphatase activity、heparin binding等(圖 3A)。GO分析的生物過程結果顯示這些差異表達的lncRNA富集結果如下：positive regulation of inflammatory response、blood coagulation、immune response和blood vessel morphogenesis等(圖 3B)。KEGG 信號通路富集分析結果表明這些差異lncRNA可能涉及到很多信號通路，排名第1的是Protein processing in endoplasmic reticulum，大概會有16個lncRNA參與其中。富集結果同樣表明lncRNA富集的“化學致癌”和“剪接體”可能參與了白血病的發生發展，其中最為經典的“Notch信號通路”，同樣可能參與了白血病的發生 (圖 3C)。

圖3 GO和KEGG分析差異表達前200位lncRNA高度富集的通路

2.3 ATPR組中lncRNA的順式調節與反式調節

lncRNA主要通過調節染色體的結構來發揮功能，最為經典的是除了順式調控的方式調節自身轉錄，還可以通過調節自身近端的基因表達來發揮作用。為了探究篩選的差異表達lncRNA的功能，以期找到潛在的lncRNA的順式調控基因，課題組篩選了這些差異表達lncRNA上游和下游100 kb范圍內的染色體相關基因。根據以上介紹的標準，發現很多新的lncRNA可以順式調控基因的表達。lncRNA參與一些生物途徑可能與轉錄因子有關。Pearson相關分析預測與前200個差異表達的lncRNA所相關的轉錄因子。進一步計算轉錄因子與lncRNA的相關性，發現TAF7、E2F4、KAT2A、TBP、BCLAF1和GTF2F1是最豐富的轉錄因子。為了進一步探索lncRNA的轉錄調節功能，通過 Cytoscape 軟件對前 100 對 lncRNA-轉錄因子調控制作更為直觀的可視化核心網絡圖，按照

P

值從小到大排序，二元關系網絡圖使用前100行的調控關系作圖(圖4A)，三元關系網絡圖取前10行的調控關系作圖(圖4B)。該圖顯示這些轉錄因子可以調節很多lncRNA的表達。

圖4 差異表達lncRNA順式和反式調節預測分析

3 討論

ATRA對腫瘤細胞的增殖具有很好的抑制作用，并且還可以誘導其分化。但是ATRA具有很多副作用，如耐藥、維甲酸綜合征等，這大大限制了它的使用。為了避免這些副作用，本課題組前期對ATRA進行結構改造，合成了一系列的維甲酸衍生物，經過前期的藥效學篩選，發現ATPR可以在一定程度上抑制腫瘤細胞的增殖并且誘導其分化，如 K562 細胞、NB4細胞。lncRNA 由于不具有編碼任何蛋白質的能力，一直被認為是基因轉錄的副產物或者噪音，但有研究表明lncRNA與腫瘤的發生發展密切相關。因此lncRNA的研究逐漸成為白血病基因組學的新領域，lncRNA 是否可以成為ATPR治療白血病的新靶點有待深入研究。這對于白血病的治療具有重要意義。

本研究通過分析基因芯片測序ATRA和ATPR作用于 NB4 細胞后的基因表達譜，經篩選得到一批差異表達的 lncRNA，其可能成為白血病治療的新靶點。經進一步的研究表明，與ATRA比較，ATPR 可能是通過 poly (A) RNA binding、receptor activity、protein binding、MAP kinase tyrosine phosphatase activity、heparin binding 等生物學過程發揮作用。 KEGG 信號通路富集分析結果顯示，Notch 信號通路與ATPR在白血病治療中的表觀遺傳機制密切相關，提示ATPR很有可能通過 Notch 信號通路治療白血病。同時，為了進一步探究這些lncRNA在白血病中的調控方式，利用 Cytoscape 軟件構建相關lncRNA的可視化網絡圖來分析其反式調控情況，結果顯示， E2F4、TAF7、KAT2A、TBP、BCLAF1、GTF2F1 等轉錄因子對相關lncRNA具有一定的調控作用，這些轉錄因子在ATPR對白血病的治療過程中發揮重要作用。

E2F4 作為轉錄抑制因子，是屬于 E2F 轉錄因子家族的一員，它在細胞周期阻滯過程中發揮非常重要作用。Feng et al研究也表明 E2F4 與白血病的發生發展密切相關。Khaleel et al發現 E2F4 高表達會加重乳腺癌患者的病情，縮短存活期。研究結果還顯示轉錄因子 TAF7 在調節轉錄起始過程中也發揮重要作用。但是其仍需在癌癥領域進行更深層次探究?；诖?，本課題組后續將研究在ATPR治療白血病過程中，相關轉錄因子和lncRNA之間的調控機制。

綜上所述，ATPR 可以通過改變lncRNA的表達水平來調節細胞生長增殖、誘導細胞分化和凋亡等過程。這些 lncRNA 可能與ATPR抑制 NB4 細胞增殖并誘導其分化及其耐藥機制有關。