葡萄籽原花青素對糖尿病小鼠心室重構的保護作用

程雨微，王小云，查紅英，凌鑫鑫，潘 銘，阮承少，王君萍，高 杉，朱德發

糖尿病是以高血糖、高血脂為特征的代謝性疾病，近年來，其發病率逐年增高并呈年輕化趨勢，糖尿病誘發的臟器損傷尤其是心血管損傷是導致糖尿病患者死亡的主要原因，其病死率是非糖尿病人群心血管疾病的2～3倍，其中，糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)是重要并發癥之一，是導致糖尿病病人死亡的重要原因。DCM概念最早是由Rubler和Hamby發現和提出，主要表現為心臟微血管病變和心肌細胞代謝紊亂所致的心臟廣泛局灶性病變。DCM早期表現為心肌順應性降低、充盈受限為主的舒張功能不全，晚期變現為收縮功能障礙和全心衰竭。目前已達成共識，DCM是心血管終點事件的獨立風險因素，其發生不依賴于高血壓、冠狀動脈粥樣硬化等常見心血管疾病。

葡萄籽原花青素(grape seed proanthocyanidins，GSP)是從葡萄種子和葡萄皮中提取的一種有效抗氧化劑，具有調節血脂，抗腫瘤，調節血糖，保護心血管的作用。GSP提取物具有強氧自由基清除能力，其抗氧化活性優于其他常用的抗氧化劑，數據顯示GSP抗氧化作用是維生素C的20倍，是維生素E的50倍；生物利用度也高于維生素C、E和β-胡蘿卜素等抗氧化劑。目前有關GSP在體降血糖的研究報道較少，本研究擬通過腹腔注射四氧嘧啶建立1型糖尿病模型，探究GSP對糖尿病小鼠心室重構的保護作用及可能的機制。

1 材料與方法

1.1 動物和材料

SPF級昆明小鼠(

n

=70)，雄性，體質量(26±2) g，購自北京維通利華實驗動物股份有限公司(No:11001119110375110，許可證號：SCXK京2016-0011)。四氧嘧啶(ALX，批號：101847561)購自美國SIGMA化學公司；GSP(批號: H27J9Z64554)購自上海源葉生物科技有限公司；二甲雙胍(metformin hydrochloride tablets,MET)(批號：20190162)購自貴州天安藥業股份有限公司。血糖儀(批號：ET80116RB)購自中國臺灣翔國科技有限公司。

1.2 糖尿病模型的建立與分組

昆明小鼠適應性喂養3 d后，禁食24 h，自由飲水，每只小鼠按140 mg/kg劑量一次性腹腔注射四氧嘧啶制備糖尿病模型。對照組小鼠腹腔注射等量的0.9%氧化鈉溶液，于注射后第5天取尾血測空腹血糖，血糖值10～25 mmoL/L為高血糖模型，即造模成功。將造模成功小鼠隨機分為5組，每組12只。對照組、模型組每日給予0.9%氯化鈉溶液灌胃，GSP低劑量組、GSP中劑量組、GSP高劑量組分別給予65、130、195 mg/kg的GSP灌胃給藥，陽性藥組給予220 mg/kg的MET灌胃給藥，連續給藥30 d。

1.3 空腹血糖降低和糖耐量實驗

給藥后每3 d取尾血測空腹血糖值至給藥周期結束，每周固定時間內記錄各組小鼠的飲食量和飲水量。末次給藥后禁食5 h。測定血糖值，15～20 min灌胃葡萄糖2.0 g/kg，測定給葡萄糖后0.5、2 h的血糖值，觀察模型組、對照組與給藥組給予葡萄糖后各時間點血糖曲線下面積的變化，從而明確糖耐量的變化。

1.4 血流動力學指標測定

小鼠末次給藥后禁食不禁水12 h，稱體質量(body weight，BW)，10%水合氯醛(0.035 ml/10 g)腹腔注射麻醉小鼠。然后迅速分離右頸總動脈，將預先浸泡于肝素中的聚乙烯導管插入其中，通過BL-420S轉換器記錄信號。待信號穩定后，將導管繼續沿著右頸動脈的方向插入左心室中，記錄血流動力學參數左室收縮壓(left ventricular systolic pressure，LVSP)、左室舒張末期壓(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)、左心室壓力變化最大速率(maximum rate of left ventricular pressure，±dp/dt)等血流動力學指標。

1.5 心臟重量指數(heart weight index，HWI)和腎臟重量指數(kidney weight index，KWI)的測定

血流動力學指標采集完成后，頸靜脈取血，然后處死小鼠，迅速取出心臟和腎臟，剔除心臟和腎臟周圍結締組織，0.9%氯化鈉溶液洗盡殘血，濾紙吸干后稱量全心重及腎重，并計算HWI(HWI=全心重/BW)和KWI(KWI = 腎重/BW)。

1.6 Masson染色觀察心臟組織膠原變化

組織切片常規脫蠟水洗，Bouin液媒染過夜，流水沖洗至黃色消失，天青石藍染色液滴染2～3 min，稍水洗。Mayer蘇木精染色液滴染2～3 min。酸性乙醇分化數秒，流水沖洗10 min。麗春紅酸性復紅液5～10 min，1%磷鉬酸分化10 min，苯胺藍或光綠液染5 min，0.2%冰醋酸浸洗，各梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，鏡檢。

1.7 免疫熒光檢測心肌組織內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)的表達

石蠟切片常規脫水，置檸檬酸鈉抗原修復液中。3%雙氧水室溫孵育，PBS沖洗，QuikBlock免疫封閉液封閉30 min。輕甩封閉液，滴加eNOS一抗(1 ∶200)4 ℃孵育過夜。復溫30 min后PBS沖洗。滴加二抗(1 ∶1 000)室溫下進行孵育。DAPI核染3～5 min，抗熒光猝滅劑封片，避光鏡檢。

1.8 酶聯免疫吸附法和比色法檢測血清學指標

采用酶聯免疫吸附法檢測血清中內皮素-1(endothelin-1，ET-1)、內皮性一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)和糖化血清蛋白的活性，比色法檢測血清中一氧化氮(nitric oxide，NO),超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和還原型谷胱甘肽(GSH)的含量。

1.9 Western bolt測定心臟組織eNOS、內皮素A受體(endothelin-1 A receptor, ETA)的表達

取新鮮心肌組織，加RIPA(radio-immunoprecipitation assay)裂解液(含1%苯甲基磺酰氟)冰上裂解，4 ℃離心(12 000 r/min，10 min)。收集上清液，80 ℃保存。取上清液, 以二喹啉甲酸(BCA)法測定總蛋白濃度。非變性eNOS通過12%的SDS聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白，ETA通過8%的SDS聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白后將蛋白轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，室溫下5%脫脂奶粉封閉1 h，漂洗 3×10 min，加入一抗(eNOS，1 ∶5 000，美國Abcam公司；ETA，1 ∶500，(武漢博士德公司)4 ℃孵育過夜。次日再漂洗PVDF膜3次，加入二抗(山羊抗兔，1 ∶10 000，上海碧云天公司)，室溫孵育1 h。漂洗后ECL試劑顯色。

2 結果

2.1 GSP對糖尿病小鼠動態血糖、糖耐量、糖化血清蛋白的影響

與對照組相比，造模后模型組血糖值明顯升高。而經過GSP和MET治療后，與模型組相比，各給藥組血糖明顯降低(圖1A)，血糖曲線下面積明顯減小，糖耐量值明顯降低(圖1B),血清糖化血清蛋白活力明顯降低(圖1C)，差異有統計學意義(

P

<0.05，

P

<0.01)。

圖1 GSP對實驗性糖尿病小鼠動態血糖水平、糖耐量和糖化血清蛋白的影響

2.2 GSP對糖尿病小鼠飲食飲水量的影響

與模型組相比，經GSP各劑量組和MET治療后，給藥組每10 g體質量24 h動態飲食飲水量明顯減少，多飲多食癥狀有所減輕，差異有統計學意義(

P

<0.05，

P

<0.01)。見圖2。

2.3 GSP對糖尿病小鼠心功能、HWI和KWI的影響

與對照組相比，模型組小鼠的LVSP、±dp/dt、射血分數(ejection fraction，EF)、心輸出量(CO)均明顯降低，LVEDP明顯升高，見圖2。提示小鼠出現明顯的心功能不全特征。經GSP各劑量組和MET給藥治療后明顯改善了心功能參數。與對照組相比，模型組HWI、KWI有所升高，KWI的差異具有統計學意義(

P

<0.05)；與模型組相比，各給藥組HWI、KWI有降低的趨勢。見圖3。提示GSP具有一定的改善心功能不全作用。

圖2 葡萄籽原花青素對實驗性糖尿病小鼠實驗周期內動態飲食量和飲水量的影響

圖3 GSP對糖尿病小鼠HWI、KWI的影響

2.4 GSP對心臟病理形態學改變的影響

Masson染色結果顯示(圖4)，與模型組相比，各給藥組能明顯減少糖尿病小鼠的心肌膠原沉積，改善心肌纖維化，差異有統計學意義(

P

<0.01)。

2.5 GSP對血清ET-1、NO、MDA、GSH含量及

SOD活性的影響

與對照組相比，模型組血清中SOD活性、GSH含量明顯降低，MDA含量明顯增高，而經GSP與MET治療后血清中SOD活性明顯提高、GSH含量明顯升高，MDA含量明顯降低。見圖4。經GSP各劑量組和MET治療后，血清中ET-1含量明顯降低，NO含量明顯升高，差異有統計學意義(

P

<0.05，

P

<0.01)。見圖5。

圖4 GSP對實驗性糖尿病小鼠心臟組織病理形態學的影響

圖5 GSP對實驗性糖尿病小鼠血清MDA、GSH含量及SOD活性的影響

表1 GSP對糖尿病小鼠心功能的影響

2.6 GSP對eNOS、內皮素A受體表達的影響

免疫熒光、ELISA和Western blot結果顯示，與對照組相比，eNOS含量明顯降低；與模型組相比，GSP各劑量組劑量組、MET組含量明顯升高，差異有統計學意義(

P

<0.05，

P

<0.01)。Western blot顯示，與對照組相比，模型組ETA含量明顯升高；與模型組相比，各給藥組ETA的含量明顯降低。見圖7。

圖7 GSP對實驗性糖尿病小鼠eNOS和ETA表達的影響

3 討論

在糖尿病中，慢性高血糖會產生多種并發癥，不僅會導致微血管病變，也會構成大血管和心肌的病變，目前，心肌異常與糖尿病之間的因果關系已得到很好的證實。GSP作為自然界廣泛存在的多酚類化合物，其對心血管系統的活性已逐漸被人們認識。既往研究顯示GSP可通過其強大的抗氧化、改善內皮功能障礙以及降低動脈粥樣硬化風險指數、改善脂質特性等藥理學效應而發揮心肌保護作用。本研究中，與對照組相比，模型組動態血糖、糖耐量、糖化血清蛋白、飲食飲水量均明顯升高，且差異有統計學意義，提示造模成功。研究結果顯示，與模型組相比，GSP組心肌細胞橫截面積、心肌縱徑寬度、心肌膠原沉積含量均明顯減小，表明GSP可改善心肌及心肌血管周纖維化，抑制心臟損傷的發生和發展。

圖6 GSP對實驗性糖尿病小鼠血清ET-1和NO含量的影響

DCM以心肌代謝紊亂、心肌纖維化為基礎的病變, 發生心肌結構異常, 最終導致心室肥厚擴大、舒張和收縮功能障礙等。其心功能不全的臨床過程是由亞臨床異常(如左室纖維化和舒張功能障礙)發展為嚴重舒張性心力衰竭(射血分數異常)，并最終發展為收縮功能障礙伴射血分數的降低，DCM發生、發展過程中，氧化應激損傷扮演重要角色，表現為活性氧(ROS)蓄積觸發細胞膜脂質過氧化、激酶過度磷酸化和DNA突變，引起心肌細胞結構和功能異常，并導致心肌細胞不可逆損傷和凋亡發生。SOD和GSH是體內重要的內源性抗氧化劑，而MDA是脂質過氧化反應的主要終產物。因此，測定心肌中SOD活性、GSH含量以及MDA含量可以反映機體中氧自由基水平及脂質過氧化反應程度。本研究結果表明，與對照組相比，模型組血清MDA含量明顯增加、SOD活性明顯降低、GSH含量明顯下降，差異具有統計學意義(

P

<0.01)。而經各GSP劑量組、MET組給藥治療后，能明顯降低血清MDA含量，提高血清SOD活性和GSH含量。提示GSP可能通過抗氧化應激發揮保護作用，這種作用可能與其獨特的分子結構及分子結構中大量酚羥基的存在有關。