地塞米松緩釋劑腎囊植入對阿霉素腎病大鼠的保護作用

秦志強，范慢利，王 坤，章 成，周蘭蘭,3

腎病綜合征(nephritic syndrome，NS)是一種主要臨床表現為水腫、高脂血癥、低蛋白血癥和蛋白尿的疾病，并且會進一步惡化成腎功能衰竭，對身體健康會產生極大威脅。低蛋白血癥是腎臟疾病最有代表性的臨床表現，不僅是腎損傷的標志之一，而且是參與各種腎臟疾病發展的重要致病因素。根據目前的研究，在NS中蛋白尿的產生與腎小球濾過屏障的形態及功能異常之間聯系密切，尤其是足細胞裂孔隔膜的結構和功能。腎小球濾過屏障損傷的特點就是產生大量蛋白尿。

學者研究發現了包括Nephrin在內的多個由足細胞表達的分子，對足細胞發揮正常的結構與功能有著重要作用。實驗研究表明

NPHS

1基因對Nephrin進行編碼，而

NPHS

1基因突變可導致Nephrin表達缺失，導致裂孔隔膜結構遭到破壞從而產生大量蛋白尿，同時在光學顯微鏡下可見廣泛的腎小球硬化，與芬蘭型遺傳性腎病綜合征密切相關。

糖皮質激素(glucocorticoid，GC)是目前臨床治療腎病綜合征普遍使用的藥物之一。傳統激素治療是一種長期的藥物治療過程，雖然可以控制病情，但副反應表現明顯，常見表現為嚴重感染、骨質疏松和股骨頭壞死等合并癥。地塞米松緩釋植入劑(dexamethasone implant, DexI)是一種新的長效制劑，它能保持穩定和恒定的釋放。該研究旨在探討在大鼠的腎囊進行一次性注射DexI探討其對阿霉素腎病大鼠的作用以及對作用機制進行探究，為接下來進行臨床研究提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑與儀器

DexI：安徽四維藥業有限公司(合肥)提供，使用0.9%氯化鈉溶液溶解配置，現配現用，批號：20141128-2；DexI賦形劑：安徽四維藥業有限公司(合肥)提供，使用0.9%氯化鈉溶液稀釋，現配現用，批號：20140731；注射用鹽酸多柔比星：海成藥業有限公司提供，使用0.9%氯化鈉溶液稀釋配置，現配現用，批號：131101；兔抗Nephrin單克隆抗體：Abcam，貨號：AB136894；蛋白裂解液：江蘇碧云天生物技術研究所提供；蛋白酶抑制劑：江蘇碧云天生物技術研究所提供；FITC標記山羊抗兔LgG，北京中杉金橋生物技術有限公司提供，批號：122319A；免疫組化染色試劑盒，北京中杉金橋生物技術有限公司提供，批號：13152A06，122319A。

1.2 阿霉素腎病模型(adriamycin-induced nephropathy，AIN)制備及24 h尿蛋白檢測

雄性SD清潔級大鼠，體質量150～200 g，來自安徽醫科大學動物實驗中心(許可證號：SCXK(皖)2017-001)，所有實驗動物均符合美國國立衛生研究院(NIH)關于實驗動物護理和使用指南，并經安徽醫科大學動物護理和使用委員會批準(許可證號：SYXK(皖)2017-006)。隨機分為對照組和模型組，模型組大鼠尾靜脈注射阿霉素4 mg/kg，隔周再次注射阿霉素3.5 mg/kg制備腎病模型，整個成型實驗連續進行4周。實驗過程中，大鼠單獨置于特制代謝籠，禁食不禁水，收集24 h尿液，取上清液，采用雙縮脲法測定24 h尿蛋白含量。造模前及造模后每周檢測1次24 h尿蛋白，連續4周，成模后再連續檢測8周。

1.3 實驗分組給藥及腎囊注射術

1

.

3

.

1

實驗分組給藥 雄性SPF級大鼠，取成模大鼠隨機分為單純模型組(Model組)、受試藥輔料組(Exc組)、受試藥高中低劑量組(DexI 2.8、1.4、0.7 mg/kg)和地塞米松陽性對照組(Dex 0.1 mg/kg)。對照組隨機分為正常對照(WT組)和假手術組(Sham組)，假手術組進行手術操作而沒有腎內注射，模型組處以手術操作以及DexI的腎囊穿刺，輔料組進行手術操作以及在腎囊內注射對照賦形劑(1.4 mg/kg,Accessory組)，受試藥組分別在腎囊內一次性地塞米松注射給藥(2.8、1.4、0.7 mg/kg)。陽性藥對照組采用灌胃給藥地塞米松(0.1 mg/kg，qd)，連續給藥8周。

1

.

3

.

2

腎囊注射術 水合氯醛(300 mg/kg)麻醉大鼠，無菌條件下行背部正中切口，逐層剝離皮膚、肌肉、腹膜，分別暴露大鼠兩側腎囊，使用特制針進行藥物的腎囊內注射，完成注射后對手術切口逐層縫合，最后在切口處滴加青霉素注射液(現配現用)進行消毒。

1.4 阿霉素腎病大鼠腎功能檢測

造模前及造模后每2周進行1次血肌酐(serum creatinine，SCR)和尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)檢測。采樣時對大鼠使用內眥靜脈取血后處理得到血清，采用堿性苦味酸法分光光度計檢測比色，測算血清SCR含量。采用氨基硫脲與二乙酰一肟在磷酸溶液反應方法分光光度計檢測比色，測算血清BUN含量。

1.5 阿霉素腎病大鼠腎臟HE病理組織學檢查

實驗結束后，麻醉大鼠，用預冷0.9%氯化鈉溶液和濃度為4%多聚甲醛灌注后取腎，依次用4%多聚甲醛及20%和30%蔗糖水溶液固定。按標準操作制備石蠟切片。每組選擇4只動物制作切片，使用光學顯微鏡(200×)觀察腎皮質，每張動物切片選取5個高倍視野。。

1.6 免疫組織化學法檢測阿霉素腎病大鼠腎組織Nephrin的表達

大鼠腹腔注射水合氯醛(350 mg/kg)，按上述方法灌流取腎，常規制備石蠟切片，采用過氧化物酶標記的鏈霉卵白素法染色法染色。具體操作步驟按試劑說明書進行。每組4只動物，每張切片選取5個高倍視野，顯微鏡下觀察切片Nephrin表達，采用Image-Pro Plus 6.0專業圖片分析軟件測量免疫陽性產物平均光密度(MOD)值。

1.7 免疫印跡法檢測阿霉素腎病大鼠腎組織Nephrin的表達

實驗結束后處死大鼠，摘取腎臟，取腎皮質50 mg，加入400 μl 蛋白裂解液和 10 μl 蛋白酶抑制劑研磨，提取總蛋白。按照標準操作流程進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。使用專屬Bioshine ChemiQ 4600化學發光成像系統對圖片進行收集工作，對收集的圖片使用Image J軟件測定目的蛋白對應的條帶與對應內參條帶之間灰度值的比值。

2 結果

2.1 大鼠AIN的建立

建立改進版AIN模型，AIN處理的動物在造模1周后出現體質量值下降、活動性降低、毛發脫落、進食量降低等表征。建模2周后，大鼠出現明顯的全身性水腫以及毛發直立等現象。建模3周后，24 h尿蛋白開始增加一直持續到12周，血肌酐(表1)和尿素氮(表2)于第4周開始上升，一直持續到12周。模型建立12周后，大鼠外觀明顯消瘦。如圖2所示，根據切片觀察得出AIN處理的病理學表現為腎小管大量擴張、系膜區增大、部分腎小球萎縮、腎小管上皮細胞呈空泡狀、炎性細胞大量浸潤、局部組織纖維化等典型特征。

表1 地塞米松植入劑一次性腎囊植入對阿霉素腎病大鼠血肌酐的影響

表2 地塞米松植入劑一次性腎囊植入對阿霉素腎病大鼠尿素氮的影響

2.2 DEXI對AIN大鼠24 h尿蛋白的影響

造模前及造模后每周檢測1次24 h尿蛋白，結果見圖1所示。造模前各組含量無明顯差異，與假手術組比較，模型組24 h尿蛋白從第3周開始增加持續到第12周(

P

<0.05，

P

<0.01)。與模型組比較，第6周開始，DexI各組24 h尿蛋白開始降低，持續至12周，差異有統計學意義(

P

<0.05，

P

<0.01)。從第7周開始，口服陽性對照Dex組24 h尿白開始下降并持續至12周，差異有統計學意義(

P

<0.05，

P

<0.01)。治療第8～12周，高劑量DexI降尿蛋白作用強于Dex，差異無統計學意義。

圖1 DexI對阿霉素腎病大鼠不同時間段24 h尿蛋白的影響

2.3 DEXI對阿霉素腎病大鼠腎功能的影響

根據表1和表2數據，與假手術組比較，進行DexI處理的大鼠在第4周至第12周血肌酐和尿素氮明顯增加，具有統計學意義(

P

<0.01)，與對照組數據比較具有統計學意義(

P

<0.05，

P

<0.01)。與模型組相比，AIN大鼠的血肌酐水平在DEXI各組中的第6周至12周降低，差異有統計學意義(

P

<0.05，

P

<0.01)，口服地塞米松對照組給藥后第8～12周血肌酐水平下降，差異有顯著性(

P

<0.01)。與模型組相比，受試藥各組和地塞米松陽性對照組給藥后第8～12周均可顯著降低阿霉素腎病大鼠的尿素氮水平，差異有統計學意義(

P

<0.05)。

2.4 DexI改善AIN誘導的腎臟組織病理學的破壞

經HE染色處理，在光學顯微鏡下觀察(×200)，正常組和假手術組腎組織沒有發生明顯改變(圖2A、B)。單純AIN處理組和單純DexI賦形劑可觀察到明顯變化，包括明顯地腎小管舒張、部分腎小球萎縮、上皮細胞呈現空泡樣、系膜細胞增生、腎囊壁加厚、腎球囊出現明顯粘連、毛細血管淤塞、伴隨炎性細胞大量浸潤、腎纖維化(圖2C、D)。治療8周后，受試藥各劑量組和地塞米松陽性對照組炎性細胞浸潤均有明顯改善，腎小管舒張和腎間質纖維化均有明顯改善(圖2E～G)。DexI高劑量組間質組織無腎小球出血和炎性細胞浸潤(圖2E)?？诜栃詫φ誅ex組有輕度腎小球出血，間質組織中仍有炎性細胞浸潤(圖2H)。

圖2 DexI處理對AIN大鼠腎組織病理學的影響 HE染色 ×200

2.5 DexI對AIN大鼠腎組織Nephrin表達的的影響

根據免疫組化實驗結果，Nephrin在正常對照組和假手術組幾乎沒有陽性表達，而在單純AIN處理組和DexI賦形劑組表達明顯；陽性表達主要沿著腎小球毛細血管呈現袢線性分布，可觀察到明顯的棕色顆粒狀。與正常組對比，單純AIN處理組和DexI賦形劑組Nephrin陽性表達明顯增加，差異有統計學意義(

P

<0.01)。與模型組相比，DEXI各劑量組和口服地塞米松陽性對照組可顯著降低大鼠腎組織Nephrin的表達，差異有統計學意義(

P

<0.05，

P

<0.01)。見圖3。

表3 DexI處理對AIN大鼠腎組織病理學分級程度分布的影響(n=4，只)

圖3 DexI對AIN腎組織Nephrin表達的影響 免疫組化 ×400

2.6 DexI對AIN大鼠腎組織Nephrin表達的影響

與正常對照和假手術組相比，單純AIN處理組和DexI賦形劑組Nephrin蛋白的表達量明顯增加，差異有統計學意義(

P

<0.01)。與模型組相比，DexI高、中、低劑量和口服地塞米松陽性對照可顯著抑制大鼠腎組織Nephrin蛋白表達水平的增加，差異有統計學意義(

P

<0.05，

P

<0.01)。見圖4。

圖4 地塞米松植入劑腎囊植入對阿霉素腎病大鼠腎組織Nephrin表達的影響

3 討論

腎病綜合征以大量蛋白尿、低蛋白血癥、高脂血癥和水腫為特征，最終可導致腎功能衰竭。目前，臨床缺乏對腎病綜合癥有效的治療手段。本研究旨在探討一種新的地塞米松緩釋劑對阿霉素腎病的治療作用。采用一次性腎囊植入受試藥的方法，并與連續8周口服藥物進行比較。

建立一種可靠、穩定的腎病綜合征動物模型，是研究腎病的重要手段，也是開發新的、有效藥物的前提。Pereira et al建立的阿霉素腎病動物模型是目前公認的能較好模擬人類CDC的動物模型。本實驗建立模型后連續觀察8周，大鼠外觀明顯消瘦，一般狀態差，NS受損金指標24 h尿蛋白持續穩定升高，腎功能也持續異常。病理組織學顯示腎小管擴張，部分腎小球萎縮，系膜細胞增生，系膜區增大，腎小管上皮細胞空泡樣改變，大量炎性細胞浸潤，局灶性纖維化等典型阿霉素腎病改變。

與AIN組相比，DexI一次性腎囊植入的大鼠一般情況好，干預4周后，水腫癥狀及腹瀉癥狀減輕，精神狀態基本恢復，食物和飲水量明顯增加(本文未作數據顯示)。與口服對照大鼠比較，DexI植入劑組大鼠擁有更高的體質量和更好的狀態。受試藥各組和口服8周陽性對照組24 h尿蛋白含量均明顯下降，并可顯著降低血肌酐及尿素氮水平，改善腎功能，表明地塞米松植入劑一次性腎囊植入可與長期口服藥一樣，可以保護阿霉素腎病大鼠的腎功能損害，并可有效降尿蛋白。DexI高劑量組的降尿蛋白等作用強于口服給藥組。

糖皮質激素是目前用于治療腎病綜合征的常規藥物之一。然而，糖皮質激素對足細胞和腎小球的保護作用機制尚未明確。有研究表明，可能與影響足細胞裂孔隔膜相關蛋白分子的表達和分布有關。足細胞蛋白在形成完整的抗蛋白尿過程中起著關鍵作用，維持足細胞結構和腎小球濾過屏障功能。Nephfin是芬蘭科學家Kestina在1998年首次鑒定的蛋白分子，特異性分布于裂孔隔膜。NS大鼠腎組織Nephrin表達與蛋白尿的嚴重程度呈正相關。本研究免疫組化和Western blot 檢測均發現，阿霉素腎病大鼠造模12周后 Nephfin表達明顯升高上升。DexI各組一次性腎囊植入和長期口服治療均可顯著下調Nephrin蛋白的過度表達，且DexI作用更強。

目前，有關阿霉素腎病大鼠Nephfin蛋白表達與尿蛋白的相關性呈現兩種結果，Xing et al研究從造模第1周開始持續升高至第4周，結果顯示Nephfin蛋白表達與病情正相關，與本研究結果高度一致，本研究阿霉素腎病造模一直延續至第12周。但也有研究顯示，阿霉素腎病大鼠Nephrin蛋白是減少的，與尿蛋白呈現負相關關系。不同研究結果可能與建模過程中取材時間點有關，有文獻顯示整個造模過程中，Nephrin蛋白表達量呈現動態變化特點，可能對應著腎臟疾病發展的不同階段。

總之，該實驗表明地塞米松緩釋植入劑作為一種新的藥物劑型，通過腎囊植入，一次給藥，可以明顯達到與長期口服給藥同等甚至更好的效果，改善阿霉素腎病大鼠的癥狀，增強其抵抗力，并能對抗病理組織學的損傷。其作用機制可能與下調足細胞Nephrin蛋白的表達，保護腎小球濾過屏障損傷有關。該新制劑對腎病的保護作用及在減少藥物副作用和并發癥方面的作用需要繼續探討。