SAMHD1蛋白在食管癌中的表達特點及其臨床意義

黃云龍, 張仁泉, 姚 龍, 寧光耀

食管癌是一種高病死率和預后差的惡性腫瘤，總體5年生存率低于13%，究其原因，一方面由于腫瘤侵襲和轉移導致復發和預后不良，另一方面因食管癌臨床診斷時常偏晚期。盡管已有廣泛報道在食管癌中有多個基因突變，但仍不全面了解其發生發展的分子機制。最近，一種新的細胞內抗病毒因子，由真核生物SAMHD1基因編碼的全稱為不育-α-基序結構域(SAM域)和組氨酸/天冬氨酸殘基雙聯體結構域(HD域)包涵蛋白1的蛋白，在癌癥中的差異表達被越來越多的人所關注。已有研究表明SAMHD1在慢性淋巴細胞白血病、結腸直腸癌、肝癌、肺癌、皮膚T細胞淋巴瘤等癌癥中的降低。該研究通過免疫組化的方法檢測食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)中SAMHD1的表達水平，分析SAMHD1表達與ESCC臨床病理參數及患者生存預后之間的關系，為ESCC的診治及預后評估提供新思路。

1 材料與方法

1.1 病例資料

標本源于安徽醫科大學第一附屬醫院2009年1月—2013年12月期間收治的204名食管鱗狀細胞癌患者，統計其詳細的術后臨床病理資料且根據UICC/AJCC 第8版食管癌TNM分期標準進行嚴格術后病理分期，并跟蹤隨訪生存預后情況。所有患者均未接受任何術前放化療，并且他們都接受了微創食管癌切除手術。

1.2 試劑

SAMHD1的小鼠抗人單克隆抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司。免疫組化試劑盒(SP-9001)購自北京中杉金橋生物有限公司。

1.3 免疫組化

使用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法(streptavidin-peroxidase，SP)檢測實驗標本中SAMHD1表達。將樣本固定在4%中性多聚甲醛中，常規包埋在石蠟中，連續切成4 μm切片，并使用HE方法常規染色以進一步確認病理診斷。然后進行免疫組織化學染色。將石蠟切片用二甲苯脫蠟，用梯度乙醇水合，浸入3%HO溶液，并在室溫下用滅活內源性過氧化物酶溫育10 min。使用0.01 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液(pH = 6.0,95～100 ℃，20 min)在加熱的水浴中修復抗原。在室溫冷卻后，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌樣品，加入小鼠抗人SAMHD1單克隆抗體，然后在37 ℃恒溫下持續培養2 h。然后將它們用PBS漂洗3次(每次5 min)，加入生物素標記的第二抗體，在室溫下孵育30 min，再次用PBS洗滌3次(每次5 min)。使用DAB作為顯色劑，用蒸餾水沖洗樣品，用蘇木精染色，用乙醇和二甲苯脫水，用中性膠密封。選擇陽性表達SAMHD1的多形性膠質母細胞瘤標本作為陽性對照，用PBS替換一抗后獲得陰性對照。

1.4 評估標準

SAMHD1表達在細胞質或細胞核上顯示為黃色或棕色染色為陽性，并且在細胞質或細胞核中為黃色或棕色顆粒。在高倍視野(×400)下觀察，每個切片檢查隨機5個惡性細胞區域，基于陽性染色細胞的數量和顏色深度，使用半定量評分確定結果：陽性細胞百分比≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，> 75%為4分。關注陽性細胞的顏色深度，基本上沒有著色為0點，淺黃色為1點，淺棕色為2點，深棕色為3點。在將2個得分相乘后得到分數進行判別：0～2分為陰性結果，3～4分為弱陽性，5～8分為中度陽性，9～12分為強陽性；將陰性和弱陽性定義為低表達，中等陽性和強陽性定義為高表達。見圖1。

圖1 ESCC組織中SAMHD1免疫組織化學染色表達 SP×400A：強陽性；B：中度陽性；C：弱陽性；D：陰性

1.5 統計學處理

應用SPSS 20.0軟件進行統計分析，用χ檢驗比較在不同組之間SAMHD1表達與臨床病理參數的相關性。采用Kaplan-Meier法繪制累積生存率曲線和無進展生存率曲線，計算累積生存率及無進展生存率，Log-rank檢驗進行生存分析。

P

<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SAMHD1在ESCC中的表達情況

SAMHD1主要在ESCC細胞的細胞質或細胞核中表達，204例ESCC組織中SAMHD1免疫組織化學染色表達水平，119例高表達，強陽性有59例(圖1A)，中度陽性有60例(圖1B)；85例低表達，弱陽性有33例(圖1C)，陰性有52例(圖1D)。

2.2 SAMHD1表達與食管癌臨床病理特征的關系

SAMHD1的表達在患者的年齡、性別、腫瘤(T、N、TNM)分期、上縱膈淋巴結的轉移間差異無統計學意義。與腫瘤長徑<4 cm的相比，腫瘤長徑≥4 cm的病例中，SAMHD1低表達更為顯著(

P

=0.013)，且腫瘤分化程度越差，SAMHD1表達越低(

P

=0.001)，有腹腔淋巴結轉移的食管癌病例中SAMHD1的表達更低(

P

=0.044)。見表1。

表1 SAMHD1在ESCC組織中的表達與臨床病理特征的關系

2.3 SAMHD1表達與食管癌患者預后的關系

2

.

3

.

1

SAMHD1在ESCC中的表達對累積生存率和無疾病進展生存率的影響 與高表達SAMHD1組相比，低表達SAMHD1組的累積生存率更低 (圖2A),差異有統計學意義(

P

=0.044)；與高表達SAMHD1組相比，低表達SAMHD1組的無進展生存率更低 (圖2B), 差異有統計學意義(

P

=0.011)。

圖2 SAMHD1在ESCC中的表達對累積生存率和無疾病進展生存率的影響

2

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3

.

2

204例患者臨床特征影響累積生存率和無疾病進展生存率的單因素分析 累積生存率和無疾病進展生存率的單因素分析如表2所示：腫瘤大小、T分期、N分期、TNM分期、上縱膈淋巴結轉移、腹腔淋巴結轉移、SAMHD1表達影響累積生存率(

P

<0.05)，而腫瘤大小、分化程度、T分期、N分期、TNM分期、上縱膈淋巴結轉移、腹腔淋巴結轉移、SAMHD1表達影響無疾病進展生存率(

P

<0.05)。

表2 204名患者臨床特征影響累積生存率和無進展生存率的單因素分析

2

.

3

.

3

患者臨床特征影響累積生存率和無疾病進展生存率的多因素分析 累積生存率和無疾病進展生存率的多因素分析結果見表3：腹腔淋巴結轉移是影響累積生存率的危險因素(

P

<0.05)，分化程度、T分期、轉移、腹腔淋巴結轉移、SAMHD1表達是影響無疾病進展生存率的危險因素(

P

<0.05)。

表3 204名患者臨床特征影響累積生存率和無進展生存率的多因素分析

3 討論

臨床資料表明，ESCC患者術后5年生存率遠高于未行手術切除的。然而，由于早期ESCC沒有明顯的癥狀且臨床缺乏其早期診斷檢測方法，大多數ESCC患者被診斷時為晚期，并且失去了手術最佳治療窗口。當前，傳統的腫瘤標志物，如CEA和細胞角蛋白19片段，被用于診斷和評估ESCC進展。但是，CEA和Cyfra 21-1檢測的敏感性和有效性不足以進行早期ESCC檢測。因此，迫切需要能夠早期ESCC檢測的改良生物標記。

SAMHD1在細胞中的生理功能是通過其dNTP酶活性維持細胞內dNTP的體內平衡。dNTPs由核糖核苷酸還原酶(RNR)合成并由SAMHD1水解。Franzolin et al發現SAMHD1在細胞靜止期中表達最高，在培養人體細胞中于細胞周期的S期表達最低。且外，在增殖細胞中SAMHD1的下調抑制了細胞周期進程和dNTP庫的調節，這表明SAMHD1是DNA前體庫的重要調節因子。因此，推測SAMHD1的下調或功能障礙可導致異常的dNTP池和異常細胞周期，可以誘發癌細胞的產生。SAMHD1在幾種癌癥中的突變或下調，與本研究中食管鱗狀細胞癌中的低表達結果相吻合。以上結果表明SAMHD1可能是一種潛在腫瘤抑制因子。此外，與參與細胞周期負調控的

Rb

、

p

53、

CDKN

2

A

等抑癌基因和負調控轉錄因子的

WT

、

DCC

等基因相似，

SAMHD

1作為腫瘤抑制基因，參與腫瘤發生發展，并且如上述研究結果表明，SAMHD1與食管鱗狀細胞癌的臨床病理學特征具有相關性，SAMHD1低表達的食管鱗癌患者中，其臨床病理中腫瘤直徑大、腫瘤分化程度差且腹腔淋巴結陽性轉移率也高，均預示著腫瘤遠期預后較差，且通過單因素與多因素分析結果判斷，食管鱗狀細胞癌中SAMHD1的表達與患者預后具有相關性，即SAMHD1越低表達，食管鱗狀細胞癌患者的生存預后越差。

總之，SAMHD1在ESCC組織中的表達明顯低于配對的正常組織，并與腹腔區域淋巴轉移、TNM分期和腫瘤組織學分化程度相關。較低SAMHD1表達的ESCC患者中，術后生存率及無進展生存率亦較低。因此，SAMHD1可作為預測ESCC腫瘤進展和預后的分子標記物。同時，設想通過一定的方式恢復SAMHD1在癌細胞中的表達，甚至有所提高，也可以成為癌癥治療的一個手段。