急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者外周血miRNA-23a表達(dá)及其與臨床參數(shù)的相關(guān)性分析

孫廣瀚，劉 健，萬 磊，姜 輝，龍 琰，鮑丙溪，張 穎

急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎(acute gouty arthritis,AGA)是一種主要由嘌呤代謝紊亂和(或)尿酸排泄減少所引起的炎癥性、晶體性關(guān)節(jié)炎，屬于代謝性風(fēng)濕病，其主要表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的急慢性關(guān)節(jié)炎、形成痛風(fēng)石、腎功能出現(xiàn)障礙等。微小RNA(MicroRNA,miRNA)是小的非編碼RNA，涉及多種生物學(xué)過程的調(diào)控，與機(jī)體免疫功能和自身免疫耐受有關(guān)。miRNA與控制基因表達(dá)相關(guān)，具有生物標(biāo)志物和治療劑的作用。研究表明miR-23a在炎癥、代謝等方面以轉(zhuǎn)錄后的方式調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，并可作為炎癥負(fù)性調(diào)控因子而在原發(fā)性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的炎癥免疫反應(yīng)過程中起到重要作用。該研究通過定量PCR檢測AGA患者血漿miR-23a的表達(dá)，并分析其表達(dá)與實(shí)驗(yàn)室參數(shù)和患者感受參數(shù)的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 病例資料

外周血樣本共40例，來源于20例AGA患者(AGA組)和20例健康人(正常組)。AGA組為隨機(jī)抽樣2019年6—9月間在安徽省中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科收治確診者，其中男19例，女1例，年齡17～78歲(43.65±14.57)歲，均符合2015年美國風(fēng)濕病學(xué)會/歐洲抗風(fēng)濕聯(lián)盟(ACR/EULAR)聯(lián)合制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)。20例正常組為同期健康體檢者，年齡分布與AGA組大致匹配，排除心血管、腫瘤以及其他自身免疫性疾病，其中男10例，女10例，年齡18～72歲(36.40±14.82)歲。經(jīng)兩獨(dú)立樣本

t

檢驗(yàn)兩組年齡

P

=0.482，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2 主要試劑和儀器

TRIzol(貨號：15596018)由美國Life technogies公司提供；三氯甲烷、無水乙醇、異丙醇由上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司提供；DEPC-H2O(貨號：D1007)由上海捷瑞生物工程有限公司提供；Novostart SYBR qPCR SuperMix Plus(貨號：E096-01A)由上海近岸蛋白質(zhì)科技有限公司提供；RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit(貨號：K1622)、PIKO Plate Illuminator(型號：10212432C)由美國Thermo Scientific公司提供；hsa-miR-23a-5p miRNA qPCR Detection Primer Set(貨號：BK1010T0004496)由南通百奧邁科生物技術(shù)有限公司提供。普通PCR儀(型號：K960)由杭州晶格科學(xué)儀器有限公司提供；高速臺式冷凍離心機(jī)(型號：JW-3021HR)由合肥嘉文儀器裝備有限公司提供；熒光定量PCR儀(型號：PIKOREAL 96)由美國Thermo Scientific提供；微孔板迷你離心機(jī)(型號：MINI-P25)由杭州奧盛儀器有限公司提供。

1.3 實(shí)時熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)

使用TRIzol試劑從細(xì)胞中提取總RNA。首先在0.2 ml EP管中，去除基因組DNA反應(yīng)，PCR儀上42 ℃加熱2 min，立即冰浴1 min。在上述EP管中加入PrimeScript RT Enzyme Mix I 1.0 μl、RT Primer Mix 1.0 μl、RNase Free dHO 4.0 μl、RevertAidTM M-MuLV Reverse Transcniptase 4.0 μl。在PCR儀進(jìn)行加熱，37 ℃、15 min，85 ℃、5 s。取出上述反應(yīng)液，即為cDNA，-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｗ詈笕〕鯿DNA作為熒光定量的模板，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。以β-actin作為參照進(jìn)行計算，計算使用2方法執(zhí)行。

1.4 實(shí)驗(yàn)室參數(shù)

炎癥參數(shù)：超敏C-反應(yīng)蛋白(hypersensitive C-reactive protein，hs-CRP)、紅細(xì)胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate,ESR)、α1-酸性糖蛋白(α1-acidglycoprotein, AAG)；免疫指標(biāo)：免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、補(bǔ)體C3(complement 3，C3)、補(bǔ)體C4(complement 4，C4)、尿酸(uric acid, UA)；代謝指標(biāo)：總膽固醇(total cholesterol,TC)、三酰甘油(triglycerides,TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)。

1.5 量表評分方法

全部患者均進(jìn)行焦慮自評量表(self-rating anxiety scale,SAS)、抑郁自評量表(selfrating depression scale,SDS)、生活質(zhì)量量表(the MOS item short from health survey, SF-36)的調(diào)查。由本課題小組成員在病房當(dāng)面詢問，填入紙質(zhì)問卷，最后由本課題小組成員電腦錄入統(tǒng)計。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)室參數(shù)聚類分析

不同實(shí)驗(yàn)室參數(shù)的不同患者的聚類分析結(jié)果見圖1。將實(shí)驗(yàn)室參數(shù)共聚為2類：UA、AAG為聚1類，HDL-C、LDL-C、Hcy、ESR、TG、C3、C4、IgM、IgG、IgA、hs-CRP、TC為聚2類。熱圖其顏色表示實(shí)驗(yàn)室參數(shù)數(shù)值大小，數(shù)值越大顏色越深(紅色10.00為上調(diào)，藍(lán)色0.00為下調(diào))，其中UA表達(dá)最為顯著，其次是AAG。每行表示實(shí)驗(yàn)室參數(shù)在不同患者中的數(shù)值情況，每列表示每位患者標(biāo)本號情況。

圖1 實(shí)驗(yàn)室參數(shù)聚類分析

2.2 外周血miR-23a表達(dá)檢測特異性分析

外周血標(biāo)本提取的miRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，采用定量PCR檢測。miR-23a及U6基因是內(nèi)參基因定量PCR的熔解曲線為單峰。橫坐標(biāo)為熔解溫度，縱坐標(biāo)為相對熒光單位。見圖2。

圖2 外周血miR-23a實(shí)時熒光定量PCR的熔解曲線

2.3 miR-23a在AGA組、正常組外周血中的相對表達(dá)量

AGA組(1.24±0.36)miR-23a在外周血中的相對表達(dá)量與正常組(0.41±0.11)相比較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

t

=-9.82，

P

<0.05)。

2.4 外周血中miR-23a表達(dá)水平與實(shí)驗(yàn)室參數(shù)的相關(guān)性分析

外周血中miR-23a表達(dá)水平與HDL-C、LDL-C、TG呈正相關(guān)(

P

<0.05)，與其余項(xiàng)相關(guān)性無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

表1 外周血中miR-23a表達(dá)水平與實(shí)驗(yàn)室參數(shù)的相關(guān)性分析

2.5 患者生活質(zhì)量各維度積分與外周血中miR-23a表達(dá)水平相關(guān)性分析

通過相關(guān)性分析得出，生理機(jī)能、生理職能、軀體疼痛、一般健康、精力、社會功能、情感職能、焦慮、抑郁與外周血中miR-23a表達(dá)水平相關(guān)系數(shù)值分別為：

r

=-0.392，

P

=0.087；

r

=-0.257，

P

=0.275；

r

=-0.217，

P

=0.357；

r

=-0.349，

P

=0.131；

r

=-0.182，

P

=0.442；

r

=-0.291，

P

=0.213；

r

=-0.47，

P

=0.038；

r

=-0.386，

P

=0.093；

r

=-0.251，

P

=0.286。其中外周血中miR-23a表達(dá)水平與情感職能呈負(fù)相關(guān)(

P

<0.05)，與其余項(xiàng)相關(guān)性無統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

AGA是一種單鈉尿酸鹽沉積關(guān)節(jié)所致的晶體相關(guān)性關(guān)節(jié)病，屬于代謝性風(fēng)濕病范疇，近年來我國AGA發(fā)病率明顯上升。有研究表明，AGA患者血漿中表達(dá)上調(diào)的為miR-3146、miR-4449和miR-4654，表達(dá)下調(diào)的為miR-451a、miR-223-3p和miR-22-3p等，且部分miRNA已被證實(shí)為脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)因子。miR-23a在癌癥方面研究的較多，其表達(dá)與靶基因X連鎖的凋亡抑制蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，可以作為非小細(xì)胞肺癌早期診斷的潛在生物標(biāo)志物，是胃癌的癌基因(在臨床胃癌組織中表達(dá)上調(diào))。在調(diào)節(jié)炎癥方面，miR-23a可以通過直接炎性體軸導(dǎo)致神經(jīng)性疼痛，在體內(nèi)和體外研究中改善了敗血癥誘導(dǎo)的肺損傷，還可以通過抑制自噬/芐氯素1調(diào)節(jié)因子1基因調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞自噬活性參與皮膚光老化進(jìn)程。

本研究表明AGA患者外周血中miR-23a表達(dá)水平均高于正常組，說明外周血中miR-23a表達(dá)上調(diào)可能是參與AGA的發(fā)生發(fā)展。并且通過相關(guān)性分析，外周血中miR-23a表達(dá)水平與HDL-C、LDL-C、TG呈正相關(guān)(

P

<0.05)。HDL-C、LDL-C、TG同屬于代謝指標(biāo)，而痛風(fēng)主要誘因就是進(jìn)食肥甘厚味導(dǎo)致患者不能正常代謝。并且足夠的證據(jù)可表明尿酸和脂質(zhì)代謝之間的關(guān)系，有研究推測脂肪組織使大量的游離脂肪酸進(jìn)入肝臟, 加速了嘌呤合成途徑中5′-磷酸戊糖的活化導(dǎo)致尿酸相對增加，從而導(dǎo)致痛風(fēng)急性發(fā)作。同時在成脂分化中，miR-23a與3T3-L1脂肪細(xì)胞中的脂質(zhì)蓄積和甘油三酸酯含量有密切聯(lián)系，這提示miR-23a參與脂肪的轉(zhuǎn)錄。

隨著醫(yī)學(xué)模式的轉(zhuǎn)變, 人們開始重視生存質(zhì)量的研究，醫(yī)師也不僅僅著眼于疾病的發(fā)展，而且重視疾病對患者感受的影響。AGA長期反復(fù)發(fā)作常困擾患者，影響患者的生活，對患者的心理也產(chǎn)生嚴(yán)重的影響。可以借助SF-36量表應(yīng)用于評價AGA患者生命質(zhì)量和臨床效果，根據(jù)該研究通過相關(guān)性分析也反映了患者外周血中miR-23a表達(dá)水平與情感職能呈負(fù)相關(guān)，反映出miR-23a表達(dá)越高，情感職能表達(dá)越低，miR-23a表達(dá)上升可能導(dǎo)致患者情感職能的受到限制。

綜上所述，miR-23a表達(dá)上調(diào)可能反映AGA的疾病進(jìn)展和患者預(yù)后的過程，并且miR-23a可能與代謝指標(biāo)、情感職能相關(guān)。代謝指標(biāo)尤其是血脂異常是AGA發(fā)病的重要機(jī)制。這些結(jié)果進(jìn)一步提示miR-23a表達(dá)上調(diào)可能通過代謝途徑參與AGA的發(fā)病過程，其作用機(jī)制有待于進(jìn)一步探討。