β-葡萄糖苷酶活性穩定化技術在柑橘產品增香中的應用

張晨,賈蒙,馬亞琴

(西南大學柑桔研究所,國家柑桔工程技術研究中心,重慶,400712)

柑橘是全世界種植面積最廣且最為重要的水果品種之一,素有“水果之王”的美譽[1]。據資料顯示,2018年中國柑橘產量為4 138.1萬t[2]。因受消費習慣和柑橘品種分布及產量的影響,我國各柑橘加工產品所占比例存在較大差異。近年來以柑橘罐頭進出口量占果蔬罐頭比重較高,而盡管我國柑橘汁消費比例較低,但其進口量卻呈現出上升的趨勢,2018年,達到了約為9.7×104t[3]的歷史新高。繼果汁和橘瓣罐頭之后,柑橘果酒憑借著其獨特的風味和營養保健功能逐步引起了消費者的青睞,對柑橘加工產品風味物質特別是增香技術的研究及優化成為企業和研究人員的關注熱點。

β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)又稱β-D葡萄糖苷水解酶,在增香領域具有潛在優勢,于1837年首次在苦杏仁汁中發現[4],隨后陸續在自然界多種生物體及一些尚未定義的物種中均有發現。所有的生物體內幾乎都存在著β-葡萄糖苷酶,但其在不同的生物體中結構與組成不同[5]。它在微生物領域中作為一種重要的纖維素酶類,可應用于纖維素材料的生物降解和生物轉化過程當中。此外,β-葡萄糖苷酶還在生物體的糖代謝途徑中發揮著至關重要的作用,可以水解結合于末端、非還原性的β-D葡萄糖苷鍵并釋放出β-D葡萄糖與相應的配基[6]。近年來,針對β-葡萄糖苷酶可以切斷糖苷鍵合態香氣物質中配基與糖基之間的糖苷鍵并釋放出香氣的特性被逐漸應用到食品的增香領域中。糖苷結合風味物質的研究起源于1969年FRANCIS等[7]對玫瑰花瓣中糖苷形式單萜醇進行的檢測與研究。1993年進一步研究發現,大多數C13去甲基類異戊二烯揮發性化合物幾乎都源于糖苷前體物衍生,糖苷結合風味物質的研究引起了科研人員的關注[8]。此后,人們對糖苷類芳香化合物的研究迅速增多,包括葡萄、茶、柑橘等。其中對于柑橘而言,β-葡萄糖苷酶不僅能夠增加柑橘汁中香氣物質的種類和含量[9],同時還可以和α-L-鼠李糖苷酶組成柚苷酶用于水解柑橘類果實當中重要的苦味物質柚皮苷,已有研究優化了柚苷酶對柑橘類果汁的最佳脫苦工藝且脫苦效果理想[10]。但對于β-葡萄糖苷酶的活性而言,柑橘加工過程中所處環境的pH,乙醇、葡萄糖、溫度等都極大的限制了β-葡萄糖苷酶的活性進而影響了其增香效果。

為了提高β-葡萄糖苷酶在柑橘加工所處復雜環境下的活性及穩定性,更好地滿足消費者對柑橘加工產品品質的要求,本文從β-葡萄糖苷酶的酶活性測定及增香和脫苦原理出發,進而綜述了其在柑橘加工所處復雜環境中活性穩定化技術方面的研究現狀,并展望了不同技術的應用前景。

1 β-葡萄糖苷酶的酶活力測定方法

酶活力測定方法與β-葡萄糖苷酶在柑橘加工過程中活性穩定化技術的研究緊密相聯。選取一種適合的酶活測定方法不僅可以在酶活性穩定化技術研究中快速、準確地測定出相應酶活力,并且具有著較好的重現性。

目前,β-葡萄糖苷酶測定方法主要有以水楊苷為底物的分光光度法、以4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖苷(3-methylumbelliferyl-β-D-glucopyranoside，4-MUG)為底物的熒光法[11]及以對硝基苯-β-D-葡萄糖苷(4′-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside，pNPG)為底物的比色法[12]。其中,分光光度法由于其適合檢測酶解底物產生極微量的葡萄糖,故酶解底物過程中伴有的其他物質將容易影響其測定結果,檢測靈敏度較差[13]。相比于實驗過程中操作繁瑣以4-MUG為底物的熒光法而言,以pNPG為底物的比色法因其在實驗中具有簡易的操作方式,較好的重現性及其快速,準確的測定結果而更為常用,但其兩者酶解產物均可能受到一些與它們具有相同吸收波長物質的干擾,如具有藍色背景的生物樣品容易與4-MUG熒光法酶解產物的藍色熒光發生重疊現象,pNPG比色法酶解后生成的黃色對硝基苯酚與柑橘汁及柑橘酒顏色相近,從而可能會影響400 nm左右對硝基苯酚的吸光度[14-15]。因此,當進行柑橘中β-葡萄糖苷酶酶活力測定過程中存在生色團干擾時,還可以通過測定其釋放出的葡萄糖及釋放出的酚類物質含量來計算其酶活力[16]。近期,WANG等[17]基于點擊化學反應原理建立了一種以2-O-β-D-葡萄糖基-L-抗壞血酸為底物的β-葡萄糖苷酶酶活力測定方法,其因檢測波長短于以pNPG為底物的比色法和以4-MUG為底物的熒光法而能有效避免部分體系在高于400 nm范圍內的干擾,此為不同實際檢測體系中β-葡萄糖苷酶活性的測定提供了新的選擇方案。表1是不同來源β-葡萄糖苷酶的一些基本性質。

表1 不同來源β-葡萄糖苷酶的基本性質Table 1 The basic properties of β-glucosidase from different sources

2 β-葡萄糖苷酶的增香及脫苦原理

香氣影響著柑橘加工產品的品質,在柑橘加工過程中產品的脫苦和增香相輔相成,是加工技術的重要環節。β-葡萄糖苷酶酶解前后,紅橙果汁中酸類、醇類、醛類在種類和含量上均有所上升,并基于果汁原有風味的基礎上增添了安息香醛、3-蒈烯等風味物質,進而在感官評定表中顯示果汁樣品分值提升,表明β-葡萄糖苷酶在果汁的口感及風味方面具有良好的增香效果[9]。

柑橘的香氣物質由可被人們感知到的游離態香氣物質和只有經過酸解或酶解釋放后才可以被人們感知到的以糖苷形式存在,且不具有揮發性的糖苷鍵合態香氣物質所組成。其中較為重要的鍵合態香氣物質是以萜烯類物質、C13降異戊二烯類物質及苯的衍生物為配基的糖苷鍵合態物質,β-葡萄糖苷酶能夠水解糖苷鍵合態香氣物質中配基與糖基之間的糖苷鍵,從而達到增香的目的,若水解過程中糖苷與雙糖連接,則需要α-L-鼠李糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶或β-木糖苷酶等外切酶對其外糖切割以后,再由β-葡萄糖苷酶切割釋放糖苷配體,水解過程如圖1所示。

圖1 糖苷鍵合態香氣物質的水解過程Fig.1 Hydrolysis of glycoside bound aroma compounds

此外,柑橘的脫苦同樣也是柑橘增香過程中的關鍵,“后苦”現象是在柑橘果實經過放置或加工過程中產生的,嚴重影響產品的口感和風味,并掩蓋了產品本身及其在加工過程中所產生的香味。柑橘中的苦味物質主要分為兩大類,黃烷酮糖苷類化合物和三萜類化合物,柚皮苷和檸檬苦素分別為兩者的代表性物質,且相比于柚皮苷而言,檸檬苦素苦味閾值很低,苦味約為柚皮苷苦味的20倍[26-27]。但檸檬苦素主要分布于果實的種子中[28],可以通過去除種子的方式使檸檬苦素類似物對柑橘苦味的影響程度大為降低。因此對于柚汁及一般帶皮榨汁的柑橘類果實而言,柚皮苷為苦味的主要來源,利用柚苷酶酶解柚皮苷可脫苦,1938年首次在芹菜種子中分離得到柚苷酶[29],由α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶組成。柚皮苷首先被α-L-鼠李糖苷酶水解為櫻桃苷和鼠李糖,其次在β-D-葡萄糖苷酶的作用下櫻桃苷生成無苦味的柚皮素和葡萄糖,水解過程如圖2所示。

圖2 柚皮苷在柚苷酶作用下水解過程Fig.2 Hydrolysis of naringin under the action of naringinase

3 β-葡萄糖苷酶提高柑橘加工產品香氣的應用

β-葡萄糖苷酶酶制劑的純度、產量、活性及穩定性對柑橘加工產品的香氣至關重要,直接影響著柑橘在加工過程中糖苷鍵合態香氣物質水解效率的高低及脫苦效果。柑橘在加工過程中β-葡萄糖苷酶的活性、穩定性容易受到加工條件的影響導致增香效率的降低。目前,已有相關研究人員綜述了葡萄酒發酵過程中如何提升β-葡萄糖苷酶的活性及穩定性[30],但在柑橘加工所處復雜環境中β-葡萄糖苷酶活性穩定化技術研究較少,故可選用微生物產酶的方式、酶的固定化技術、釀酒酵母表面展示技術及酶的半理性設計技術來提高β-葡萄糖苷酶在柑橘加工所處復雜環境中的活性及穩定性,進而提升其在柑橘加工過程中的增香效率。

3.1 微生物產酶

目前,由于微生物來源的β-葡萄糖苷酶酶活性、穩定性普遍高于植物的,故為采用微生物來源的β-葡萄糖苷酶[31-32]。近年來,針對柑橘在釀酒過程中缺乏專用的酵母菌株造成柑橘果酒風味不佳,研究人員在柑橘專用酵母菌株篩選方面的研究日益增多,其中菌株的釀酒特性、揮發性物質濃度、氣味活性值、感官評價得分均作為柑橘酒發酵候選品種篩選的關鍵指標[33]。

在柑橘果酒發酵過程中,相比于有些可以產生豐富β-葡萄糖苷酶的非釀酒酵母而言[34],由于釀酒酵母普遍不具備合成β-葡萄糖苷酶的能力而導致柑橘果酒經商業釀酒酵母菌株發酵后風味不佳[35]。非釀酒酵母菌菌株與釀酒酵母菌菌株聯合發酵產生的揮發性香氣物質,特別是高級醇和酯類物質含量高,有利于改善柑橘酒的感官品質[36]。對此,HU等[37]為篩選適合柑橘酒發酵的非釀酒酵母菌菌株,采用理化方法和固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用技術對10株非釀酒酵母菌菌株的釀酒特性和揮發性組分進行了研究,并選擇了揮發性物質濃度、氣味活性值、感官評價得分均較高的Hanseniasporauvarum、Hanseniasporaopuntiae、Hanseniasporaoccidentalis、Pichiakudriavzevii及Torulasporadelbrueckii作為柑橘酒發酵的候選品種。而對葡萄酒中微生物來源的β-葡萄糖苷酶增香效果研究時發現,微生物來源的β-葡萄糖苷酶在葡萄酒生產當中具有較高的穩定性,且經過β-葡萄糖苷酶處理的葡萄酒中萜烯濃度高于未經處理的葡萄酒,萜烯酚作為葡萄酒中賦予新鮮果香的主要單萜類物質之一[38],其含量比未經處理的對照組顯著增加了約27倍[39]。但柑橘酒方面還鮮有文獻能夠像對葡萄酒中微生物來源的β-葡萄糖苷酶增香效果進行研究,原因可能在于柑橘酒脫苦工藝的不完善導致脫苦效果不理想且柑橘汁糖分較低,不利于自然發酵等,因此需深入分析并評估其在柑桔產品中的增香效果。

3.2 β-葡萄糖苷酶的固定化

β-葡萄糖苷酶的固定化是指將酶限制于一定區域內仍可保留其催化活性并可重復回收使用的一項技術,其中β-葡萄糖苷酶不僅作為一種高效的糖苷水解催化劑,而且作為柚苷酶的重要組成部分,在柑橘果汁的脫苦方面也發揮了至關重要的作用。因此,良好載體的篩選既可以拓寬固定化后β-葡萄糖苷酶pH值和活化溫度范圍,并且可使固定化后的柚苷酶在酸性pH和低溫條件下的活性最適,從而使其在保持橙汁營養和感官特性的前提下適用于柑橘汁等酸性環境,這對于更好地提升柑橘加工產品的香氣及柚子汁脫苦效果的改善具有潛在的應用價值[40-41]。近期,β-葡萄糖苷酶穩定性隨著新型固定化材料Eupergit C的發現得到了很大的提升,且可以耐受酒精度為18%、pH<3.0及葡萄糖質量濃度為100 g/L的溶液[42],相對于葡萄酒所處發酵環境相似的柑橘酒而言,新型材料Eupergit C的發現基本克服了β-葡萄糖苷酶在柑橘加工產品中應用的壁壘。此外,將柚苷酶固定在經過戊二醛活化的殼聚糖微球上對柚子汁進行脫苦時,柚子汁的脫苦效果和感官品質均得到了較大改善[45]。

3.3 釀酒酵母表面展示技術

固定化技術為保持酶的穩定性提供了一條有前景的途徑,但固定材料的高成本和復雜的純化過程阻礙了其大規模的工業應用。細胞表面展示技術可以避免繁瑣的純化和固定化過程,使表達的多肽以融合蛋白的形式展現在核糖體、病毒或細胞表面進而篩選、進化具有優良特性的基因編碼肽分子。

釀酒酵母表面展示系統的步驟是將釀酒酵母細胞壁蛋白與目標蛋白融合,然后由胞壁蛋白通過共價鍵或非共價鍵形式連接在細胞壁上。ZHANG等[43]為評估細胞表面展示技術在葡萄酒增香領域中的應用潛力,利用不同的啟動子(GPD和SED1)和糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定區(Sag1、SED1和Cwp2)在釀酒酵母的細胞表面構建了β-葡萄糖苷酶顯示系統,并對典型釀酒條件下顯示的β-葡萄糖苷酶的穩定性及其在發酵結束時作為全細胞生物催化劑水解糖苷的能力做了研究,研究結果表明與商業酶相比,顯示的β-葡萄糖苷酶不僅在pH 3.0和葡萄糖質量濃度低于25 g/L時均可表現出較高活性,而且具有更好的釋放游離萜醇的能力。因此,相比于傳統固定化技術而言,其優勢是可以在其表面形成與細胞內環境相類似的保護層,當把β-葡萄糖苷酶展示在釀酒細胞表面時,不僅降低了葡萄糖對GH3家族β-葡萄糖苷酶活性的抑制作用,并且增加了酶的穩定性[44-45]。由于柑橘酒所處的發酵環境與葡萄酒所處發酵環境相似,因此表面展示系統對于提升柑橘加工產品香氣方面提供了新的可行性解決方案。

3.4 β-葡萄糖苷酶的半理性設計

半理性設計是繼理性設計之后出現的一種酶的定向進化方法,與酶的固定化、釀酒酵母展示技術相比而言,其優勢是不需要高成本的固定材料和繁瑣的純化過程,同時避免了因柑橘加工過程中產生的酒精會抑制酵母生長而對β-葡萄糖苷酶固定效果造成的影響[46]。其作用原理是對β-葡萄糖苷酶基因進行定點突變以獲得可以在柑橘加工所處復雜環境條件下保持較高活性及穩定性的酶[47]。近年來,基于提高β-葡萄糖苷酶葡萄糖耐受性、乙醇耐受性及低溫耐受性開展了相關研究以期為半理性設計提供理論基礎。

3.4.1 葡萄糖耐受性

鑒于葡萄糖由于其反饋抑制作用會限制β-葡萄糖苷酶的實際應用效果,基于在葡萄糖與β-葡萄糖苷酶互作機理,對β-葡萄糖苷酶進行定向改造非常重要。GIUSEPPE等[48]為探討GH1家族葡萄糖耐受性顯著高于GH3家族的問題,通過分析比較2個家族β-葡萄糖苷酶晶體結構的差異得出活性位點的可及性和葡萄糖耐受性之間存在著明顯的相關性,GH3家族的β-葡萄糖苷酶葡萄糖耐受性相比于GH1家族較低的原因在于其袋口寬大且催化通道較淺有助于葡萄糖分子更多地進入到酶活性位點。此與KONAR等[49]、SUSHANT等[50]的研究結果相似,表明了活性位點袋口的寬窄與催化通道的長短可能直接影響著葡萄糖進入β-葡萄糖苷酶活性位點的難易程度,且當葡萄糖、疏水性殘基積聚在活性位點袋口處時將會阻礙葡萄糖分子與活性位點結合,從而使得β-葡萄糖苷酶對葡萄糖的耐受性升高。因此,β-葡萄糖苷酶的葡萄糖耐受性取決于葡萄糖進入β-葡萄糖苷酶活性位點的難易程度,可通過阻礙葡萄糖分子與活性位點結合來提高β-葡萄糖苷酶對葡萄糖的耐受性進而在很大程度上保留酶活力。

3.4.2 乙醇耐受性

乙醇作為一種有機溶劑,β-葡萄糖苷酶的活性會隨著柑橘酒發酵過程中乙醇含量的升高而降低。研究發現,溶液里大部分酒類酒球菌菌株中β-葡萄糖苷酶活性在酒精體積分數達到4%時已經受到強烈抑制[51],而導致酶活性損失的潛在因素之一為β-葡萄糖苷酶的構象隨著有機溶劑濃度的升高而發生了變化[52]。對此,提高β-葡萄糖苷酶乙醇耐受性可以通過對β-葡萄糖苷酶中穩定性較差的氨基酸進行定點突變,加強氨基酸之間的疏水力和氫鍵來提高蛋白質結構當中的非共價相互作用力以使得β-葡萄糖苷酶對乙醇的耐受性增強[47]。此外,KARNAOURI等[53]研究用甲醇當有機溶劑時,β-葡萄糖苷酶能夠有效合成甲基-葡萄糖苷鍵,并且酶本身在體積分數50%的乙醇中具有較高的穩定性,這表明了β-葡萄糖苷酶對乙醇的耐受性可能與其存在著更強的親核試劑發生的轉糖基化活性及轉糖苷能力有關。

3.4.3 低溫耐受性

柑橘酒的發酵溫度通常低于30 ℃,而β-葡萄糖苷酶活性的最適宜溫度通常高于45 ℃,這對適合于低溫發酵的柑橘酒而言是一個極具挑戰性的問題,如何通過提高β-葡萄糖苷酶的低溫耐受性改善柑橘酒的風味至關重要。研究人員嘗試從嗜冷和耐冷細菌中分離出屬于GH3[54]和GH1家族的幾種冷適應β-葡萄糖苷酶,并通過對比嗜冷菌中的β-葡萄糖苷酶BglU與嗜溫及嗜熱菌中β-葡萄糖苷酶BglB和GlyTn的晶體結構及編碼序列,將BglU結構中特有的L3環縮短,其在低溫下的催化活性將會降低；若將299位置上的His突變為Tyr,酶的最適溫度將會提高[55]。相反地,將BglB的Tyr301突變為His,酶的最適溫度將會降低[56]。SUN等[57]從海洋細菌中克隆了一個可以編碼冷適應β-葡萄糖苷酶的新基因(Bgl)并置于大腸桿菌中表達,且經Ni2+層析純化,純化后的β-葡萄糖苷酶最適溫度為25～45 ℃,這可能是因為其特殊的基因編碼序列決定了其特有的結構,而這種結構致使其擁有了較好的低溫耐受性,但對于純化后該β-葡萄糖苷酶的晶體結構還有待進一步研究。

4 展望

香氣和苦味物質作為柑橘汁品種的重要指標,使得β-葡萄糖苷酶在提升柑橘汁香氣和脫苦方面備受關注。然而,柑橘酒的研究難以像葡萄酒一樣進入產業化而是一直停留在試驗階段,其原因不僅在于缺乏專屬酵母,導致柑橘酒風味不佳及脫苦效果不理想,而且柑橘汁糖分較低不利于自然發酵。通過對β-葡萄糖苷酶的縱深研究可能會對柑橘加工產品品質的提升帶來新的契機。因此,未來應繼續著重于通過提高β-葡萄糖苷酶在復雜環境中活性及穩定性,進而提高柑橘加工產品香氣釋放和降低苦味來加深研究,這有助于為改善柑橘加工產品品質,并進一步推進增香技術的工業化應用提供科學依據。