基于數(shù)字化環(huán)介導等溫擴增技術(shù)的牛乳中大腸桿菌快速精準定量分析

易昌毓,羅自生,潘響亮,林星宇*

1(浙江工業(yè)大學 環(huán)境學院,浙江 杭州,310014) 2(浙江大學 生物系統(tǒng)工程與食品科學學院,浙江 杭州,310058)

在生產(chǎn)過程中極易被微生物污染從而導致牛乳變質(zhì),因此微生物超標在牛乳生產(chǎn)過程中是一個重要的衛(wèi)生安全問題[1]。大腸桿菌是乳品國家標準中規(guī)定菌群檢測項目的主要目標物,同時也是食品中糞源性污染衛(wèi)生細菌學指標[2]。常見的大腸桿菌檢測方法主要有平板計數(shù)法和分子生物學方法[3]。平板計數(shù)法是依據(jù)GB 4789.3—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 大腸菌群計數(shù)》[4]對乳品中大腸桿菌進行檢測,該方法操作簡單但會漏檢活的非可培養(yǎng)狀態(tài)菌[5]。同時,過長的檢測時間會導致檢測結(jié)果無法及時指導生產(chǎn)[6]。分子生物學方法中的聚合酶鏈式反應(yīng)法(polymerase chain reaction,PCR)[7]及實時熒光PCR法(quantitative real-time PCR,qPCR)[8]可以縮短檢測時間并測定少量核酸,但無法進行絕對定量分析[9]。同時需要安裝大體積的儀器,無法用于食品現(xiàn)場快速檢測[10]。牛乳中大腸桿菌的有效控制,要求其得到快速準確的檢測,因此,迫切需要建立一種大腸桿菌快速檢測新方法以滿足市場需求。

環(huán)介導等溫擴增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是由日本科學家NOTOMI等[11]率先建立的新型核酸擴增方法,該方法具有特異性強等特點[12],且在微生物檢測領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景[13]。LAMP反應(yīng)產(chǎn)物的檢測可以通過肉眼觀察法觀察白色焦磷酸鎂沉淀[14]以及采用電泳法觀察梯形條帶[15],但肉眼觀察法易受觀察者主觀影響,電泳法操作繁瑣且會造成假陽性污染[16]。數(shù)字化LAMP雖可利用泊松分布的原理對核酸分子進行絕對定量,但通常需要使用微流控芯片進行檢測,操作復雜且耗時長[17]。

MITRA等[18]建立的擴增方法,即在聚丙烯酰胺水凝膠中進行數(shù)字PCR擴增并使擴增產(chǎn)物限制在模板附近從而實現(xiàn)絕對定量分析。本研究通過優(yōu)化數(shù)字化LAMP反應(yīng)體系的各項參數(shù),用于實現(xiàn)乳品中大腸桿菌的快速定量。由于水凝膠基質(zhì)的限制作用,一個細菌的特定基因序列只會產(chǎn)生一個擴增子熒光亮點。因此,本研究使用熒光顯微鏡成像并通過擴增點計數(shù)來確定樣品細菌濃度,從而建立牛乳中大腸桿菌的快速檢測方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗菌種及試劑

大腸桿菌CICC 10907菌株、單核李斯特菌CICC 21633菌株、傷寒沙門氏菌 CICC 10871菌株,中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；牛乳樣品,當?shù)厥袌觥?/p>

10×Isothermal Amplification Buffer、Bst 2.0 WarmStartTMDNA聚合酶、MgSO4、dNTPs,New England Biolab公司；引物、DEPC水,生工生物工程(上海)股份有限公司；4臂-聚乙二醇-丙烯酸酯(分子質(zhì)量10 kDa)、巰基-聚乙二醇-巰基(分子質(zhì)量3 400 Da),Laysan Bio公司；Eva Green,上海閃晶分子生物科技有限公司；溶菌酶,Thermo Fisher Scientific公司；密封小室(frame-seal),Bio-rad公司；牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA),寶日安生物技術(shù)(北京)有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

MiniT-C型小型金屬浴,杭州奧盛儀器有限公司；Applied BiosystemsTM型實時PCR儀,Thermo Fisher Scientific公司；Leica DMi8型熒光顯微鏡,徠卡顯微系統(tǒng)(上海)貿(mào)易有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物設(shè)計

本研究中使用HILL等[19]設(shè)計的6條特異性引物并將其用于數(shù)字化LAMP檢測,包括2條內(nèi)引物(FIP/BIP),2條外引物(F3/B3),2條環(huán)引物(Loop F/Loop B),詳見表1。

表1 大腸桿菌數(shù)字化LAMP引物Table 1 The E.coli primer for digital LAMP

將活化的大腸桿菌、單核李斯特菌、傷寒沙門氏菌分別接種于10 mL LB、BHI和TSB液體培養(yǎng)基中,37 ℃、150 r/min過夜培養(yǎng)12～14 h。細菌濃度可以通過將10 μL不同稀釋程度的菌液分散在LB營養(yǎng)瓊脂平板上,在37 ℃下孵育12 h并計數(shù)菌落形成單位(CFU)來量化。過夜培養(yǎng)后,取1 mL新鮮細菌菌液,細菌經(jīng)玻璃珠振蕩破壁后,利用 PureLinkTMGenomic DNA Mini Kit試劑盒提取細菌DNA。

1.2.3 數(shù)字化LAMP反應(yīng)體系及特異性

對于在聚丙烯酰胺水凝膠內(nèi)部進行的LAMP反應(yīng),需要將2種聚丙烯酰胺水凝膠單體添加到LAMP反應(yīng)體系中以確保水凝膠交聯(lián),最終反應(yīng)混合物(25 μL)由以下成分組成：1.6 mg 4臂-聚乙二醇-丙烯酸酯,1.1 mg 巰基-聚乙二醇-巰基,2.5 μL 10× Isothermal Amplification Buffer,6 mmol/L total MgSO4、1.4 mmol/L dNTPs,640 U/mLBst2.0 Warm Start聚合酶,1.6 μmol/L FIB和BIP,0.2 μmol/L F3和B3,0.4 μmol/L LF和LB,1×Eva Green和2.5 μL模板或真實樣品。

將上述25 μL水凝膠反應(yīng)混合液加載到密封孵化小室中,蓋上蓋玻片,室溫下放置3～5 min使其交聯(lián),并在小型金屬浴上進行等溫擴增反應(yīng)。擴增反應(yīng)結(jié)束后將載玻片置于熒光顯微鏡下觀察,使用Image J計數(shù)軟件對熒光擴增點進行計數(shù)。為了記錄實時擴增曲線,將水凝膠反應(yīng)混合物添加到八聯(lián)管中,并使用實時PCR儀在65 ℃下孵育30 min,每隔1 min監(jiān)測反應(yīng)的熒光強度。

1.2.4 數(shù)字化LAMP反應(yīng)條件優(yōu)化

通過改變體系中環(huán)引物濃度(0、0.4、0.8 μmol/L)探究其對擴增反應(yīng)的影響。同時在65 ℃條件下對水凝膠混合液分別加熱10、20、30 min 并記錄熒光點數(shù)目,探究時間對擴增點數(shù)目的影響,優(yōu)化反應(yīng)時間以提高反應(yīng)效率。

1.2.5 DNA熱變性對反應(yīng)的影響

對DNA進行熱變性預處理,即在85和95 ℃條件下分別加熱2、5、8 min,加熱結(jié)束后置于冰盒中以保證DNA處于單螺旋狀態(tài),并進行數(shù)字化LAMP反應(yīng),通過記錄和比較熒光點數(shù)目探究DNA熱變性對反應(yīng)的影響。

1.2.6 數(shù)字化LAMP反應(yīng)檢測大腸桿菌及特異性

為了進一步減少繁瑣的實驗步驟,本實驗通過在水凝膠中加入溶菌酶和BSA,以有效裂解細菌細胞壁和防止細菌吸附到離心管管壁上,并直接進行細菌檢測。通過優(yōu)化溶菌酶和BSA濃度得到最準確的細菌數(shù)目,從而進行定量分析。

1.2.7 人工污染牛乳

在人工污染前,按照國標法檢測證實樣品不含大腸桿菌。然后對1 mL不含大腸桿菌的牛乳樣品污染不同濃度的大腸桿菌,依次為4.0×102～2.0×104CFU/mL。往水凝膠體系中加入2.5 μL人工污染牛乳樣品,此時每個實驗組中大腸桿菌的個數(shù)為1～50。

1.2.8 數(shù)字化LAMP反應(yīng)特異性

為了探究反應(yīng)的特異性,往水凝膠體系中分別加入相同濃度的大腸桿菌DNA、單核李斯特菌DNA和傷寒沙門氏菌DNA,在65 ℃條件下對水凝膠混合液加熱30 min并記錄熒光點數(shù)目。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實驗數(shù)據(jù)均以平均值±標準差表示,實驗重復3次。原始圖像用于數(shù)據(jù)分析,并通過Image J軟件測量熒光點數(shù)目。Origin Pro 9.0軟件用于統(tǒng)計分析和圖表繪制。對于圖7-e,使用線性函數(shù)y=ax+b擬合數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)字化LAMP檢測大腸桿菌方法的建立

如圖1所示,隨著反應(yīng)的進行,水凝膠陽性對照樣品中熒光強度緩慢增加,當反應(yīng)進行至6 min時,管內(nèi)熒光強度開始大幅增加,反應(yīng)至12 min時,熒光信號增加強度逐漸變緩直至反應(yīng)結(jié)束,說明溶液中發(fā)生了擴增反應(yīng)。同時,水凝膠陰性對照組熒光曲線一直處于相對平滑的狀態(tài),直到反應(yīng)終止都沒有明顯變化,說明沒有發(fā)生擴增反應(yīng)。該結(jié)果表明,水凝膠的加入不會影響LAMP擴增。

1-水凝膠陽性對照,DNA濃度為1.0×105 copy/mL；2-水凝膠陰性對照圖1 數(shù)字化LAMP檢測結(jié)果Fig.1 Detection results of digital LAMP

2.2 環(huán)引物濃度對數(shù)字化LAMP的影響

環(huán)引物濃度通常影響LAMP反應(yīng)的效率。由圖2可知,隨著環(huán)引物濃度增加,反應(yīng)出峰時間從15 min降至2 min,同時熒光信號達到最大值所用時間從20 min降至8 min。說明環(huán)引物濃度的增加可以提高反應(yīng)效率,減少反應(yīng)時間。

1～3 環(huán)引物濃度LF/LB由高到低分別為0.8、0.4 和0 μmol/L,DNA濃度為1.0×105 copy/mL圖2 環(huán)引物濃度對數(shù)字化LAMP的影響Fig.2 Impact of loop primer concentration on the digital LAMP

2.3 時間對數(shù)字化LAMP的影響

本實驗通過改變擴增時間來確定數(shù)字化LAMP反應(yīng)中熒光擴增點數(shù)目的變化情況。如圖3所示,隨著擴增時間的增加,擴增點數(shù)目逐漸增大并在20 min達到最大值,而在此之后熒光擴增點的數(shù)目變化不大,這可能是因為在20 min左右反應(yīng)已經(jīng)基本完成擴增。本實驗中主要討論的是如何在較短的時間內(nèi)如何更高效率檢測出大腸桿菌,因此,選擇擴增時間為20 min。

圖3 擴增時間對數(shù)字化LAMP擴增點數(shù)目的影響Fig.3 Impact of reaction time on the number of digital LAMP amplicon dots注:每個反應(yīng)中大腸桿菌基因組的濃度相同且均為42 copies/μL

2.4 DNA熱變性對數(shù)字化LAMP的影響

為進一步優(yōu)化數(shù)字化LAMP擴增點的數(shù)目,對DNA進行熱變性預處理,即分別在85和95 ℃加熱不同時間,DNA雙鏈部分或全部解螺旋以便于促進擴增反應(yīng)的進行。如圖4所示,隨著加熱時間的增長和加熱溫度的升高,擴增點數(shù)目均出現(xiàn)了不同程度的下降,這可能是因為過長的加熱時間和過高加熱溫度會對DNA造成破壞,從而影響擴增反應(yīng)。

圖4 DNA熱變性對數(shù)字化LAMP擴增點數(shù)目的影響Fig.4 Impact of DNA denature on the number of digital LAMP amplicon dots注:每個反應(yīng)中大腸桿菌基因組的濃度相同且均為100 copies/μL

2.5 溶菌酶對數(shù)字化LAMP的影響

為實現(xiàn)對大腸菌的直接檢測,往體系中加入溶菌酶水解細菌細胞壁,并對釋放的基因組進行直接擴增,同時將未添加溶菌酶的實驗組作為空白對照組。如圖5所示,添加溶菌酶實驗組擴增點數(shù)目與提取的DNA處理組擴增點數(shù)目十分接近,而未添加溶菌酶的空白對照組數(shù)目遠遠少于2個實驗組的擴增點數(shù)目,因此溶菌酶可用于細菌的裂解和直接擴增實驗。

a-DNA熱變性預處理；b-添加溶菌酶實驗組；c-未添加溶菌酶對照組圖5 溶菌酶對數(shù)字化LAMP的影響Fig.5 Impact of lysozyme on the digital LAMP注:每個反應(yīng)中大腸桿菌的濃度相同且均為42 CFU/μL

2.6 BSA對數(shù)字化LAMP的影響

本實驗使用按DEPC水梯度稀釋的大腸桿菌菌液以及溶菌酶進行數(shù)字化LAMP反應(yīng)，并對BSA質(zhì)量濃度進行優(yōu)化。如圖6所示,隨著BSA質(zhì)量濃度的增加,熒光擴增點的個數(shù)增加，實驗結(jié)果越接近給定菌液濃度,可信度越高,同時應(yīng)盡量避免高質(zhì)量濃度BSA抑制擴增反應(yīng),因此,選擇適宜的BSA質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL。

圖6 BSA對數(shù)字化LAMP擴增點數(shù)目的影響Fig.6 Impact of BSA concentration on the number of digital LAMP amplicon dots注:每個反應(yīng)中大腸桿菌的濃度相同且均為20 CFU/μL

2.7 數(shù)字化LAMP檢測牛乳樣品中大腸桿菌及反應(yīng)特異性

用優(yōu)化的方法對牛乳中大腸桿菌進行快速檢測。牛乳中菌液濃度與所檢測到的熒光點個數(shù)成線性關(guān)系,如圖7所示。該方法所得到的結(jié)果與平板培養(yǎng)法非常接近(R2=0.999 8)。同傳統(tǒng)平板計數(shù)法相比,本方法檢測可在20 min左右完成,靈敏度可降至單個細菌,大大縮短檢測周期而且操作簡便。同時在加入相同濃度的大腸桿菌DNA、單核李斯特菌DNA和傷寒沙門氏菌DNA后,僅有大腸桿菌DNA實驗組觀測到熒光點,如圖7-f所示,這是因為本實驗中所提供的引物序列主要用于檢測大腸桿菌,說明該方法具有很高的特異性。

a-1個大腸桿菌熒光圖；b-10個大腸桿菌熒光圖；c-25個大腸桿菌熒光圖；d-50個大腸桿菌熒光圖；e-菌液濃度和擴增點個數(shù)擬合圖；f-特異性圖7 數(shù)字化LAMP檢測牛乳中大腸桿菌關(guān)系圖及反應(yīng)特異性Fig.7 Detection plot of digital LAMP amplicon dots derived from milk inoculated with E.coli and response specificity

本實驗建立的數(shù)字化LAMP可以快速準確定量樣品中大腸桿菌的數(shù)目,檢測限可低至0.4 CFU/μL,因此本研究所建立的一種基于數(shù)字化LAMP計數(shù)檢測牛乳中大腸桿菌的方法具有可行性。

3 結(jié)論

本研究利用LAMP反應(yīng)產(chǎn)物在聚乙二醇水凝膠中發(fā)生數(shù)字化擴增并與熒光染料結(jié)合發(fā)出熒光的特點,并在擴增結(jié)束后通過熒光顯微鏡觀察到明顯的熒光擴增點,通過改變BSA質(zhì)量濃度、擴增時間等條件優(yōu)化實驗結(jié)果,使用圖像處理軟件Image J 計數(shù)來實現(xiàn)絕對定量檢測和分析,建立了一種基于數(shù)字化環(huán)介導等溫擴增技術(shù)檢測大腸桿菌的方法。與普通基因檢測方法相比,本研究所提出的數(shù)字化LAMP方法特點是：(1)具有很高的特異性和靈敏度,可以達到單拷貝基因檢測的水平,實現(xiàn)DNA的絕對定量分析；(2)相比PCR,本技術(shù)不需要熱循環(huán),只需恒溫加熱即可;(3)不需要對細胞破碎以提取DNA,從而簡化實驗步驟,縮短了檢測周期,提高了檢測效率。通過對人工污染的樣品進行檢測，結(jié)果表明經(jīng)過20 min就可完成牛乳中大腸桿菌的檢測。本研究探索了一種特異性強、靈敏度高、操作便捷的分子檢測大腸桿菌的技術(shù),為大腸桿菌及其他細菌的快速檢測提供了新的發(fā)展方向。