轉化生長因子-β1 受體依賴的心肌纖維化伴隨大電導鈣激活鉀通道的表達和功能下調

李磊，董亞輝，楊探，李秋芳，聶永梅，李光，于風旭

心肌成纖維細胞約占非心肌細胞90%以上，在維持心臟結構和功能中起重要作用。有研究表明，心肌微血管密度下降可能導致心肌纖維化加重[1]。此外，當某些刺激因素比如轉化生長因子-β1（TGF-β1）、血管緊張素Ⅱ（Ang Ⅱ）等刺激心肌成纖維細胞后，心肌成纖維細胞發生表型轉換為肌成纖維細胞，后者可大量合成Ⅰ型膠原（Collagen Ⅰ）、Ⅲ型膠原（Collagen Ⅲ）等細胞外基質[2]。大量膠原致過度沉積及異常分布將導致心臟間質重構，進而引起心肌纖維化。

大電導鈣激活鉀通道（big conductance Ca2+-activated K+channel,BKCa）是鉀通道中重要成員之一，不僅對細胞內Ca2+濃度具有敏感性，對電壓也具有敏感特性[3]。大量研究表明，BKCa 的開放、關閉以及突變與多種疾病的發病機制有關[4-5]。Ha 等[6]發現硫化氫（H2S）可下調人心房成纖維細胞上BKCa的表達從而抑制心肌纖維化的進展，表明BKCa 可能參與心肌纖維化過程。

TGF-β1 是目前已知最強的促進纖維化的細胞因子之一[7]。有多篇文獻報道，TGF-β1 是心肌纖維化過程中的關鍵因子[8-10]。而TGF-β1 參與心肌細胞纖維化的機制是否與BKCa 有關目前還不得而知。SB431542 被證明具有抑制TGF-β1 介導的纖維化作用[11-12]。本實驗使用SB431542 抑制TGF-β1 信號通路，探索TGF-β1 在促進纖維化過程中與BKCa 可能的關系，以為心肌纖維化的預防和治療提供思路。

1 材料與方法

實驗動物：出生 2～3 d 的乳大鼠，購自西南醫科大學動物實驗中心。

主要實驗試劑：DMEM 高糖培養基（Hyclone 公司，美國），TGF-β1（Bioyknbs 公司，美國），SB431542（Sigma 公司，美國），超純RNA 提取試劑盒（康為世紀公司，中國），逆轉錄試劑盒（東洋坊公司，日本），實時熒光定量PCR（qRT-PCR）試劑盒（Qiagen 公司，德國），BKCa 抗體（Abcam公司，美國），α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）抗體（Abcam 公司，美國），Collagen Ⅰ抗體（Abcam公司，美國），Collagen Ⅲ（Abcam 公司，美國），TGF-β1 受體抗體（Abcam 公司，美國），蛋白裂解緩沖液（碧云天公司，中國），DAB 顯色試劑盒（邁新公司，中國）。

乳大鼠心室成纖維細胞的培養、傳代：將2～3 d乳大鼠開胸取心臟，將心室剪碎、消化后收集細胞，以差速貼壁法培養成為成纖維細胞，傳至1 代后制成細胞懸液，將細胞懸液接種到6 孔板，放置于37℃、5%CO2培養箱中培養，用于后續實驗。

qRT-PCR ：根據實時PCR 引物設計原則設計引物，引物序列見表1。細胞總RNA 提取及反轉錄參照逆轉錄試劑盒說明書進行，所提RNA -80℃保存備用。采用紫外分光光度計檢測RNA 純度合格后逆轉錄為互補DNA（cDNA），cDNA 置于-80℃冰箱保存。按照qRT-PCR 試劑盒說明書進行擴增，反應條件為：95℃，2 min；95℃，15 s；57℃，30 s；循環 40 次。添加溶解曲線以驗證目的基因擴增特異性：95℃，15 s；60℃，15 s；95℃，15 s。采用 2-△△CT值的方法分析目的基因的表達水平。

表1 引物序列及產物長度

單通道及全細胞膜片鉗記錄 BKCa 電流：單通道記錄：鉗制電壓為-80 mV,刺激電壓為-60 mV。每隔1 s 刺激并記錄一次，采樣頻率為10 kH,濾波為2 kH。電極電阻為3～5 mΩ。用Clampfit 軟件分析BKCa 電流幅值、開放概率、開放時間及關閉時間。全細胞記錄：鉗制電壓為-80 mV，測試電壓從-60 mV去極化到+60 mV，脈沖階躍為+10 mV，脈沖時程為300 ms。采樣頻率為10 kH,濾波為2 kH。電極電阻為2～3 mΩ。用Clampfit 軟件分析BKCa 電流幅值、電壓依賴性、Rmap 電流峰值。

不同TGF-β1 水平對乳大鼠心室成纖維細胞 上α-SMA、Collagen Ⅰ、Collag Ⅲ和BKCa 的mRNA 和蛋白表達水平影響的檢測：將乳大鼠心室纖維細胞分為3 組：對照組、TGF-β1 5 ng/ml 組、TGF-β1 10 ng/ml 組。對照組不做處理，TGF-β1組分別給予5 ng/ml,10 ng/ml TGF-β1 處理細胞 24 h后收集細胞。qRT-PCR、蛋白免疫印跡（Western blot）分別檢測TGF-β1 處理組和對照組細胞中α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的mRNA 和 蛋白表達水平，僅檢測TGF-β1 10 ng/ml 組BKCa 的mRNA 和蛋白表達水平（經實驗組前期進行的藥物濃度和時間的篩選確定）。采用目的mRNA 和β-actin 2-△△CT做比值的方法來統計目的mRNA 的表達差異，采用目的蛋白和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）灰度值做比值的方法來統計目的蛋白的表達差異。

TGF-β1 及SB431542 對乳大鼠心室成纖維細 胞TGF-β1 受體蛋白，α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、BKCa 的mRNA 和蛋白表達水平影響的檢測：將乳大鼠心室成纖維細胞分為三組：對照組、TGF-β1 組 和TGF-β1+SB431542 組（TGFβ1+SB 組）。對照組不做任何處理，TGF-β1 組加入 10 ng/ml TGF-β1。TGF-β1+SB 組又設置三個濃度梯度：在加入10 ng/ml TGF-β1 基礎上又分別加入SB431542 0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L。處理 24 h 后將以上組別細胞收集，檢測TGF-β1 受體蛋白，α-SMA、Collagen I、Collagen Ⅲ、BKCa mRNA 和蛋白的表達水平。

TGF-β1 對乳大鼠心室成纖維細胞上BKCa 電流影響的檢測：將乳大鼠心室成纖維細胞分為對照組和TGF-β1 組，對照組不做任何處理，TGF-β1組經前期實驗篩查確定加入10 ng/ml TGF-β1 處理24 h，利用單通道膜片鉗技術記錄 BKCa 電流幅值、開放概率、開放時間及關閉時間。此外，還利用全細胞膜片鉗技術記錄BKCa 的全細胞電流幅值。

統計學分析方法：采用 SPSS 21.0 軟件進行統計分析，數據以均值±標準差表示，兩組比較采用獨立樣本t檢驗，三組及以上采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 乳大鼠心室成纖維細胞的培養及鑒定

傳代后的乳大鼠心室成纖維細胞排列逐漸緊密，相互融合（圖1），運用免疫熒光對第一代成纖維細胞進行鑒定，實驗組、對照組均加入DAPI 標記細胞核（藍色）。實驗組加入波形蛋白抗體，對照組未加入波形蛋白抗體。結果顯示，對照組僅能見到藍色細胞核（圖1A），實驗組不僅能看見藍色細胞核，還能看見綠色呈絲狀改變的胞漿，波形蛋白表達陽性（圖1B），證明所培養細胞為乳大鼠心室成纖維細胞。

圖1 乳大鼠心室第一代心室成纖維細胞免疫熒光鑒定圖

2.2 不同TGF-β1 水平對乳大鼠心室成纖維細胞上α-SMA、Collagen Ⅰ、Collag Ⅲ和BKCa 的mRNA和蛋白表達水平的影響

TGF-β1 5 ng/ml 組 和10 ng/ml 組α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的mRNA 和蛋白表達均明顯高于對照組（圖2 A～F）。TGF-β1 10 ng/ml 組BKCa 的mRNA 和蛋白表達均明顯低于對照組（P均＜0.05，圖2 G～H）。

圖2 TGF-β1 對乳大鼠心室成纖維細胞上α-SMA、Collagen I、Collagen Ⅲ和BKCa 的mRNA 和蛋白表達水平的影響（n＞3）

2.3 TGF-β1 及SB431542 對乳大鼠心室成纖維細胞上 TGF-β1 受體蛋白，α-SMA、Collagen I、Collagen Ⅲ、BKCa 的mRNA 和蛋白表達水平的影響

TGF-β1 10 ng/ml 組 的TGF-β1 受體蛋白，α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ 的mRNA 和蛋白的表達與對照組相比明顯上調，與TGF-β1 10 ng/ml+SB431542 0.1 μmol/L 組相比無明顯差異，與TGF-β1 10 ng/ml+SB431542 1 μmol/L 組，與TGF-β1 10 ng/ml+SB431542 10 μmol/L 組相比均明顯上調（P均＜0.05，圖3 A～G）。

圖3 TGF-β1 及TGF-β1 受體阻斷劑 SB431542 對乳大鼠心室成纖維細胞上TGF-β1 受體蛋白，α-SMA、Collagen I、Collagen Ⅲ、BKCa 的mRNA 和蛋白表達水平的影響(n＞3)

TGF-β1 10 ng/ml組 BKCa 的mRNA和蛋白表達量與對照組相比均明顯下調，與10 ng/ml TGF-β1+10 μmol/L SB431542 組相比明顯下調（P＜0.05，圖3 H～I）。

2.4 TGF-β1 對乳大鼠心室成纖維細胞上BKCa 電流的影響（圖4）

圖4 單通道膜片鉗記錄TGF-β1 對BKCa 電流的影響（n＞3）

在+60 mV 鉗制電壓下，與對照組相比，加入TGF-β1 后，BKCa 電流幅值被抑制，開放概率被抑制，開放時間顯著減少，而關閉時間顯著延長。全細胞膜片鉗記錄 TGF-β1 對BKCa 電流的影響結果顯示：在-60 mV 至+60 mV 鉗制電壓下，隨著刺激電壓的升高，通道電流幅值明顯升高，并且TGF-β1 組的電流幅值均低于對照組，表明BKCa具有明顯的電壓依賴性，并且在TGF-β1 處理后，BKCa 全細胞電流幅值被顯著抑制。進一步采用Ramp 電壓鉗模式記錄全細胞電流仍然表明，在TGF-β1 處理后，BKCa 全細胞電流幅值被顯著抑制。

3 討論

心肌成纖維細胞發生表型轉換為肌成纖維細胞是心肌纖維化的關鍵步驟，抑制這一過程是治療心肌纖維化的關鍵靶點。

本研究以乳大鼠心室成纖維細胞為研究對象，成功構建纖維化模型，以TGF-β1 和SB431542 為因變量，檢測細胞中TGF-β1 受體的蛋白，α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、BKCa 的mRNA 和蛋白的表達水平。本研究結果顯示，TGF-β1 可明顯上調心肌成纖維細胞TGF-β1 受體和纖維化指標的表達，同時可抑制 BKCa 的表達，TGF-β1 受體阻斷劑 SB431542 可明顯下調心肌成纖維細胞TGF-β1受體和纖維化指標的表達，同時可促進BKCa 的表達，此外我們前期的實驗發現，過表達心房成纖維細胞的BKCa 可以明顯抑制成纖維細胞α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的表達[13]，且 Ang Ⅱ通過抑制成纖維細胞上BKCa 的電流從而促進心肌纖維化進程。因此推測TGF-β1 可能是通過抑制BKCa 電流來參與心肌細胞纖維化的，該過程可能是由TGF-β1 受體介導的，BKCa 可能是Ang Ⅱ與TGF-β1 促進心肌細胞纖維化的共同作用靶點。

在乳腺癌細胞上BKCa 的作用與本研究結果一致[14]。然而，Sheng 等[15]研究發現，H2S 可抑制成纖維細胞的增殖，可能是通過抑制成纖維細胞上BKCa 的表達進而抑制成纖維細胞的增殖。同時，在子宮內膜癌HEC-1-B 細胞[16]、骨髓間充質干細胞[17]上與本研究結果不一致。目前有關BKCa 的激活、失活，對細胞增殖起到增強或抑制作用，尚不完全清楚，這也為未來的研究提供了新的方向。但就目前本研究結果分析，BKCa 參與心肌纖維化的過程，BKCa 和TGF-β1 受體可能成為心肌纖維化的潛在治療靶點。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突