AMPKα1/TLR4通路在老年糖尿病腎病病人中的表達及與NF-κB、TGF-β1水平的相關性研究

李曉艷 張汝 程瑩 莫立穩

糖尿病腎病是糖尿病病人最為常見的合并癥之一，且我國發病率呈上升趨勢，成為終末期腎臟病的第二位原因(僅次于各種腎小球腎炎)[1]。糖尿病腎病病人由于存在復雜的代謝紊亂，病程發展到終末期腎臟病后，將會增加臨床治療難度[2]。臨床研究表明：糖尿病腎病的發生常伴有炎癥因子的共同參與，能通過Toll樣受體4(TLR4)通路加劇病情發展[3]。腺苷酸活化蛋白激酶α1(AMPKα1)抑制腎臟炎癥反應，采取有效措施提高AMPK通路，能影響TLR4的生物活性[4-5]。NF-κB是P50和RelA 兩個亞基組成的二聚體，其構成的信號系統在細胞應激反應、細胞因子應答及自由基損傷中發揮了重要作用[6]。NF-κB信號系統在糖尿病腎病中發揮了重要作用，但是其具體調控機制尚未闡明。轉化生長因子-β1(TGF-β1)屬于一種新發現的調節細胞生長、分化的TGF-β超家族成員，能改變成纖維細胞貼壁生長特性，從而獲得在瓊脂中生長的能力，在炎癥、組織修復中發揮重要作用。本研究旨在探討AMPKα1/TLR4通路在老年糖尿病腎病病人中的表達及與NF-κB及TGF-β1水平的相關性，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017年3月至2019年5月我院老年糖尿病腎病病人126例作為對象，設為觀察組，符合糖尿病腎病診斷標準[7]，血肌酐<106μmol/L；HbA1c<8.0%。觀察組病人均經腎臟活檢確診，男71例，女55例；年齡60～84歲，平均(74.98±5.61)歲；病程1～12年，平均(6.39±0.71)年； BMI為20～27，平均23.19±3.23；合并癥：高血壓12例，高脂血癥7例。另選取同期81例病人作為對照組，均為腎臟切除病人(非糖尿病腎病)，未侵犯腎臟周圍組織，男49例，女32例;年齡60～85歲，平均(75.11±5.64)歲；病程1～11年，平均(6.43±0.77)年； BMI為21～28，平均23.31±3.29；病因：無功能結核腎32例，腎細胞癌36例，無功能積水腎13例；合并癥：糖尿病5例，高血壓8例，高脂血癥5例。排除標準：(1)合并血液系統疾病、急慢性腎小球腎炎的病人；(2)冠脈介入術后、慢性心功能疾病或慢性泌尿系感染者；(3)精神異常、認知功能異常或凝血功能異常者。

1.2 方法

1.2.1 AMPKα1/TLR4 mRNA水平測定：(1)實時熒光PCR檢測。①標本采集：觀察組在B型超聲引導下行經皮腎活檢(左腎)；對照組行腎臟切除術(1/2左腎)，2組將獲得的腎組織放置在液氮中，保存，備用。②標本處理：從液氮中取出腎臟組織，經10.0%中性福爾馬林24 h固定，經脫水、透明、浸蠟及常規包埋后行連續切片。③總RNA提取：向3組血清標本中加入氯仿200μL， 15 s振蕩，5 min靜置后15 min離心，離心力1216 g。去除上層清液，加入預冷的乙醇(濃度75.0%)1 mL，常溫下7 min干燥；經紫外分光度儀A260下測定吸光度值。④實時熒光PCR檢測：設置PCR參數：30 ℃ 10 min，42 ℃ 30 min，99 ℃ 5 min，5 ℃ 5 min，連續進行35個循環，72 ℃ 10 min延長，獲得最終產物并放入1.5%瓊脂凝膠電泳，β-actin為內對照。根據2-△△Ct公式完成相關參數測定：△Ct=目的基因Ct-內參基因Ct；△△Ct=觀察組△Ct-對照組△Ct。為了提高試驗測定的準確性，降低檢測過程中的人為誤差，對細胞標本均完成3次測定，取平均值，見表1。

表1 引物設計

(2)HE染色。取上述制備的切片標本，放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ缸各5 min，放入無水乙醇Ⅰ、Ⅱ缸各3 min，梯度酒精，操作完畢后用蒸餾水沖洗，放入蘇木素染色液5～15 min，自來水沖洗待細胞核變藍后鏡檢。對于背景顏色偏深的標本，放入1%鹽酸酒精完成數秒分化，放入自來水中完成10～30 min藍化，采用蒸餾水沖洗，伊紅染色完成1～3 min，常規酒精脫水后二甲苯透明，樹膠封固，倒置顯微鏡下觀察[8]。

1.2.2 NF-κB、TGF-β1水平測定：觀察組與對照組入院后次日清晨，取臥位姿勢，經肘靜脈采集外周血5 mL，35 min離心，速度3000 r/min，血清分離后放置在-80℃冰箱中，備用。采用ELISA法測定NF-κB、TGF-β1水平[9]。

2 結果

2.1 AMPKα1/TLR4 mRNA水平比較 觀察組的AMPKα1/TLR4 mRNA為1.43±0.08，顯著低于對照組(2.78±0.11)(P<0.01)。

2.2 HE染色結果比較 HE染色結果表明：觀察組腎小球毛細血管基底彌漫性增厚，伴有纖維化，且小動脈管壁內膜增厚，部分組織中伴有明顯水腫，符合糖尿病腎病病理特點；而對照組腎小球及腎小管均未見明顯病變，亦未見纖維化，見圖1。

注：A圖為觀察組腎臟組織HE染色結果；B圖為對照組腎臟組織HE染色結果圖1 2組HE染色結果比較(×200)

2.3 NF-κB、TGF-β1水平比較 觀察組的NF-κB、TGF-β1水平均高于對照組(P<0.01)，見表2。

表2 2組NF-κB、TGF-β1水平比較

2.4 老年糖尿病腎病病人AMPKα1/TLR4表達與NF-κB、TGF-β1的相關性 Pearson相關分析結果顯示，老年糖尿病腎病病人AMPKα1/TLR4表達與NF-κB、TGF-β1水平均呈負相關性(P<0.01)，見表3。

表3 老年糖尿病腎病病人AMPKα1/TLR4表達與NF-κB、TGF-β1的相關性(r，P)

3 討論

隨著我國經濟的不斷發展，糖尿病發生率呈上升趨勢，導致糖尿病腎病發生率亦呈增長趨勢。糖尿病腎病是糖尿病病人最主要的微血管病變之一，亦是病人死亡的主要原因。目前，臨床上對于糖尿病腎病發病機制尚未闡明，現代醫學治療多以強化血糖控制，抑制腎素-血管緊張素-醛固酮系統為主，但是遠期預后較差。糖尿病腎病病人常處于慢性、低度炎性反應狀態，是慢性并發癥共同的致病機制[10]。Toll樣受體(TLRs)是模式識別受體，在免疫反應中發揮了重要作用，屬于激活固有免疫的重要信號通路，能在配體的刺激下傳遞炎癥信號，從而引起炎癥細胞浸潤、炎癥因子的釋放。國外學者的研究表明：TLR4是從哺乳動物中發現的Toll樣受體，在炎性疾病中發揮了重要的作用；而AMPK屬于機體重要的能量調節開關，能作為第二信使與多條信號通港路有關，可直接參與細胞蛋白質的合成，亦可調節氧化應激、改善炎癥作用[11]。國內學者的研究表明：AMPK在糖尿病腎病中發揮了重要作用，能引起高血糖、高血脂，亦可激活TLR4活性[12]。本研究中，觀察組AMPKα1 mRNA、AMPKα1 mRNA水平均低于對照組(P<0.05)。HE染色結果表明：觀察組腎小球毛細血管基底彌漫性增厚，伴有纖維化，且小動脈管壁內膜增厚；而對照組腎小球及腎小管均未見明顯病變，亦未見纖維化。說明AMPKα1/TLR4通路在老年糖尿病腎病病人中呈低表達，且常伴有腎臟病理改變，能直接參與疾病的發生、發展。

TGF-β1屬于人體內較為常見的炎癥因子，能直接參與組織修復、胚胎的發育。臨床研究發現,TGF-β1能參與細胞的生長、分化，在免疫調節中發揮了重要的作用[13]。TGF-β1在人體中能抑制免疫活性細胞的增殖，亦可調節細胞的表型，抑制淋巴細胞、細胞因子的分化，可促進成纖維細胞、成骨細胞的生長。TGF-β1在正常人體中表達水平較低或處于動態平衡狀態，但是在糖尿病腎病病人中將呈高表達，能直接參與疾病的發生、發展。NF-κB是真核細胞中具有多向調節功能的轉錄因子，是糖尿病/糖尿病腎病微血管病發生的調節因子。在正常人體中，NF-κB以無活性的誘導形式存在于細胞漿中，當遇到應激、損傷、炎癥等各種致病因子時，NF-κB水平將呈高表達，能與細胞黏附分子、細胞因子相互作用，發揮良好的調節功能[14]。本研究中，觀察組NF-κB、TGF-β1水平均高于對照組(P<0.01)，說明NF-κB、TGF-β1在老年糖尿病腎病病人中呈高表達，能反映病人疾病的嚴重程度，而且AMPKα1/TLR4表達與NF-κB、TGF-β1水平均呈負相關性(P<0.01)。因此，老年糖尿病病人應加強AMPKα1/TLR4表達及NF-κB、TGF-β1水平測定，輔助臨床診療，延緩病情進展。

綜上所述，AMPKα1/TLR4、NF-κB以及TGF-β1在老年糖尿病腎病病人中表達異常，可能直接參與疾病的發生、發展，能為臨床治療提供了新靶點。