不同溫度條件下地衣芽孢桿菌凝乳酶的凝乳性能

李貽珍，牛珂平，曹瑛瑛，王瑩，文鵬程，喬海軍，張衛兵*，張忠明*

1(甘肅農業大學 食品科學與工程學院，甘肅 蘭州，730070)2(秦王川農業高科技產業開發示范基地管理辦公室， 甘肅 蘭州，730030)3(甘肅農業大學 理學院，甘肅 蘭州，730070)

凝乳酶(milk-clotting enzymes，MCEs)在干酪生產過程中具有極其重要的作用，它不僅具有凝乳功能，而且能參與干酪成熟過程中的蛋白水解，從而影響干酪的風味與品質[1]。隨著干酪需求量的不斷增加，傳統小牛皺胃酶的供應已經出現嚴重短缺。因而，傳統小牛皺胃酶的替代品已被廣泛研究，而微生物源凝乳酶是其替代品研究的熱點[2]。許多微生物來源(如霉菌和細菌)的胞外蛋白酶都具有凝乳功能且性質各異，其中米黑霉凝乳酶已被廣泛接受[3-4]。較植物和動物來源的凝乳酶，微生物來源的凝乳酶具有凝乳活力高、性能多樣化、生產周期短、生產成本低、便于基因改造等優點[2]。相對于真菌的固態發酵，細菌深層發酵產酶更容易自動化控制[5]。目前干酪市場需求量的增大不斷推進小牛皺胃酶替代品的研發，許多微生物凝乳酶雖然不能直接替代小牛皺胃酶，但是可以作為小牛皺胃酶的輔劑或干酪催熟劑，甚至有些可以用于開發新型乳制品[6]。AN等[1]用解淀粉芽孢桿菌中提取的微生物凝乳酶和小牛皺胃酶制作切達干酪并進行比較，發現二者成分差別不大。YANG等[7]利用枯草芽孢桿菌提取凝乳酶并運用于青藏高原所產的牦牛乳中，發現其在牦牛乳品工業中具有一定的潛力。

在凝乳過程中，影響凝乳的因素有很多，包括凝乳溫度、凝乳pH、鈣離子濃度、酶添加量等[8]。不同來源的凝乳酶對溫度的要求不同[9]，RAJESH等[10]報道的BacillussubtilisMTCC 10422凝乳酶最適溫度為45 ℃；AHMED等[11]發現Bacilluslicheniformis5A5凝乳酶在75 ℃ 條件下活性最高。溫度對凝乳酶特性的影響極為重要，例如通過影響粒子碰撞頻率，從而影響凝乳速率。溫度過低會導致膠束穩定性增加，妨礙膠束的聚集，溫度過高又會導致凝乳酶失活[12]。此外，溫度會影響凝乳活性、乳清的排出、凝塊的硬度、奶酪的出品率等[13]。

本研究利用地衣芽孢桿菌D3.11凝乳酶，探究不同溫度條件下凝乳過程中的濁度、黏度、乳清OD值、持水力、流變學特性以及微觀結構的變化規律，并與商品酶作比較，為后期凝乳酶在奶酪中的應用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

新鮮荷斯坦牛乳，甘肅農業大學奶牛場；地衣芽孢桿菌 D3.11，由本實驗室分離純化并保藏于中國典型培養物保藏中心(保藏編號為 CGMCC 3289)；麩皮，淮南鴻汶農業發展有限公司；商品凝乳酶(由70%皺胃酶和30%牛胃蛋白酶組成，活力為100 000 U/g)，深圳富晟生物科技有限公司；纖維素透析袋(12 000～14 000 Da)，上海源葉生物科技有限公司。

1.1.2 試劑

尼羅紅(超級純)，梯希愛(上海)化城工業發展有限公司；無水乙醇(分析純)，甘肅易飛儀器科技有限公司。其他試驗試劑均為國產分析純。

1.1.3 培養基

斜面種子培養基(g/L)：牛肉膏3，NaCl 5，蛋白胨10，瓊脂15，pH 7.2～7.4。

麩皮培養基:麩皮18 g，水100 mL，煮沸10 min，然后用4層紗布過濾，將濾液補水至100 mL，121 ℃滅菌25 min，pH值自然。

液體培養基(g/L)：牛肉膏3，NaCl 5，蛋白胨10，pH 7.2～7.4。

1.2 儀器與設備

754 PC型紫外可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司；LVDV-1型數字旋轉黏度計，上海方瑞儀器有限公司；LSM 800型激光掃描共聚焦顯微鏡，卡爾·蔡司股份公司；Discovery HR-1型混合流變儀，美國TA Instruments公司；真空冷凍干燥機，Scientz-ND寧波新芝生物科技股份有限公司；TGL-20型高速臺式冷凍離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司；SW-CJ-2FD型超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司。

1.3 菌株發酵試驗

1.3.1 菌種活化

將實驗室斜面保藏的Bacilluslicheniformis菌種轉接至斜面種子培養基上，恒溫培養箱中37 ℃培養24 h，接入液體培養基，37 ℃、175 r/min培養24 h。

1.3.2 粗酶液的發酵

將活化后的液體種子以4%的接種量接入麩皮發酵基中，37 ℃搖床(轉速175 r/min)培養72 h，8 000 r/min離心10 min后得到粗酶液。

1.3.3 地衣芽孢桿菌凝乳酶的制備

向粗酶液中邊緩慢攪拌邊加硫酸銨細粉末，磁力攪拌2 h，使硫酸銨充分溶解，飽和度達到20%。4 ℃離心15 min，收集上清液，緩慢加入硫酸銨至飽和度達到75%；4 ℃冰箱中靜置過夜，8 000 r/min離心10 min，收集沉淀。將沉淀溶于0.05 mol/L，pH為6.2 的磷酸緩沖液中，置于透析袋中，在4 ℃條件下透析20 h。將透析后的酶液，倒入鋁盒置于真空冷凍干燥機凍干23 h，收集酶粉，-20 ℃保存。

1.3.4 酶液的配制

稱取一定量的酶粉，溶解于磷酸緩沖液(0.05 mol/L，pH 6.2)中，將其酶活力調整為155 Su/mL，不同溫度條件下預熱5 min備用。

1.3.5 脫脂乳的制備

新鮮荷斯坦牛乳4 000 r/min離心35 min去除上層脂肪，加0.02%(質量分數)疊氮鈉備用。

1.4 不同溫度對凝乳酶的影響

1.4.1 黏度的測定

參照孔學民等[14]的方法。將脫脂乳分別水浴預熱至25、30、35、40、45、50 ℃，取不同溫度下乳樣50 mL，加入酶液，充分混勻，每隔10 min測定體系黏度值。

1.4.2 濁度的測定

參照MIZUNO等[15]的方法。將脫脂乳分別水浴預熱至25、30、35、40、45、50 ℃，取不同溫度下乳樣各5 mL，加入酶液，充分混勻，每隔5 min取適量樣品稀釋，紫外可見光分光光度計測定體系在450 nm處的透光率(T)，以(100-T)%代表濁度。

1.4.3 流變學特性的測定

參照ZHANG等[16]的方法，略作修改。分別取不同溫度條件下乳樣4 mL，加0.4 mL酶液，混勻30 s后立即轉移到流變儀玻耳帖平板上，進行時間掃描。測試溫度分別為25、30、35、40、45、50 ℃，測試探頭為60 mm平行板，間隙1 000 μm，頻率1 Hz，應力0.1 Pa，采點間隔5 s，測定時長60 min。所有測試均在線性黏彈性區域內，測定參數是儲能模量(G′)。

1.4.4 持水力的測定

參照GB 5009.239—2016[3]的方法。取5 mL脫脂乳置于10 mL離心管中，分別在25、30、35、40、45、50 ℃條件下凝乳30 min， 4 ℃、7 000 r/min離心10 min，取上清液稱重，代入公式(1)得到乳樣持水力：

(1)

1.4.5 乳清OD值的測定

參照李偉等[17]的方法。取待測乳樣5 mL置于10 mL離心管中，分別在25、30、35、40、45、50 ℃條件下凝乳30 min， 4 ℃、7 000 r/min離心10 min，取上層排出的乳清，721紫外可見分光光度計測定乳清在500 nm處的吸光值。

1.4.6 凝塊微觀結構的測定

參考LOPEZ等[18]的方法。在脫脂乳中分別添加2種酶，凝乳60 min，使用不銹鋼刀片從凝乳樣品切取4 mm×5 mm×2 mm的薄片，置于帶槽載玻片上，滴加2滴尼羅紅乙醇溶液(0.1 g/L)于暗室中染色6 min；染色結束后，用蒸餾水沖洗染料，然后蓋上蓋玻片在顯微鏡下觀察。

1.4.7 數據處理

試驗數據用SPSS 19.0軟件進行顯著性和相關性分析，Origin 8.0軟件進行繪圖。每組實驗平行測定3次。

2 結果與分析

2.1 凝乳過程中黏度的變化

圖1為不同溫度條件下，地衣芽孢桿菌D3.11凝乳酶和商品酶在凝乳過程中的黏度變化情況。由圖1可以看出，在25、30、35、40 ℃條件下，2種酶凝乳過程中黏度均先增大，而后保持穩定。當凝乳溫度為25 ℃時，地衣芽孢桿菌D3.11凝乳酶體系的黏度在30 min時達到最大值3 343 mPa·s，商品酶體系的黏度值也在30 min時達到最大值3 351 mPa·s；當凝乳溫度為30 ℃時，2種酶作用的體系黏度值均穩定上升，在30 min時達到最大值，地衣芽孢桿菌D3.11凝乳酶體系的最大值為3 143 mPa·s，商品酶體系的最大值為3 201 mPa·s；35 ℃條件下，10 min時2種體系的黏度值達到峰值，此時，地衣芽孢桿菌D3.11凝乳酶體系的黏度值為3 396 mPa·s，商品酶體系的黏度值為3 349 mPa·s；當溫度為40 ℃時，凝乳10 min后2種酶體系的黏度值達到峰值并保持穩定，此時地衣芽孢桿菌D3.11凝乳酶體系的黏度值為3 380 mPa·s，商品酶體系的黏度值為3 371 mPa·s，這表明在40 ℃條件下，地衣芽孢桿菌D3.11凝乳酶與商品酶的凝乳效果差異不大；在45 ℃條件下，凝乳10 min時商品酶體系黏度達到最大值3 379 mPa·s，地衣芽孢桿菌體系凝乳酶黏度值為3 330 mPa·s，凝乳40 min后2種酶體系黏度值均下降，且商品酶體系比地衣芽孢桿菌體系下降的更快；當凝乳溫度為50 ℃時，商品酶體系的黏度值普遍低于地衣芽孢桿菌D3.11凝乳酶體系的黏度值，且達到峰值后，商品酶體系的黏度值下降速度更快。綜上，隨著凝乳溫度的升高，蛋白質之間的相互作用不斷增強，酪蛋白膠束間距離的縮小以及蛋白分子聚集體體積的增大，最終導致體系黏度的增加，且隨著凝乳時間的延長，酶凝膠形成的同時，乳清不斷析出，導致在測定時黏度值達到最大后下降，這與ZHAO等[19]的研究結果保持一致。

a-25 ℃；b-30 ℃；c-35 ℃；d-40 ℃；e-45 ℃；f-50 ℃；圖1 不同溫度條件下凝乳過程中黏度的變化Fig.1 Change of viscosity during the skimmed milk coagulation process under different temperature 注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2 凝乳過程中濁度的變化

濁度值表示酪蛋白膠束的聚集程度[20]，濁度值越大，酪蛋白膠束聚集程度越大，膠體溶液對光透過率越低[15]。由圖2可知，30、35、40、45 ℃條件下，隨著凝乳溫度的上升，添加地衣芽孢桿菌D3.11凝乳酶與商品酶的2種反應體系的濁度逐漸增大。當凝乳溫度為25、30、35、40、45、50 ℃時，前10 min內商品酶體系濁度增長率分別為54.58%、46.17%、25.15%、22.54%、22.12%、14.72%；地衣芽孢桿菌凝乳酶體系濁度增長率分別為37.54%、32.35%、35.16%、28.45%、17.82%、10.96%。這表明，凝乳溫度越高，2種酶體系的濁度增長率越低，且商品酶體系的增長率大于地衣芽孢桿菌凝乳酶體系的增長率。在25 ℃條件下，凝乳15 min后濁度值顯著降低(P<0.05)，可能是因為溫度較低，凝乳酶活力較低，酪蛋白膠束聚集松散不穩定[20]；在50 ℃條件下，凝乳10 min后濁度值顯著降低(P<0.05)，這是由于凝乳溫度高于適宜溫度導致凝乳酶活力下降，說明溫度過高會降低凝乳效果。綜上所述，凝乳過程中，凝乳酶對溫度比較敏感，適宜的凝乳溫度對凝乳體系濁度的變化極為關鍵[21]。

a-25 ℃；b-30 ℃；c-35 ℃；d-40 ℃；e-45 ℃；f-50 ℃圖2 不同溫度條件下濁度的變化Fig.2 Change of Turbidity under different temperature

2.3 凝乳過程中的流變學特性

G′，又稱彈性模量，指在振動條件下每個應變周期所儲存的能量大小，代表凝乳網狀結構的強度。凝乳過程中G′的減小表示凝乳結構中鍵合強度與數目減少，酪蛋白之間的融合作用會導致凝乳結構在剪切作用下遭到破壞[22]。

圖3為商品酶和地衣芽孢桿菌D3.11凝乳酶凝乳體系的G′變化情況。當溫度為25 ℃時，2種酶體系的G′均隨時間的延長逐漸上升，這是由于低溫度下凝乳酶活力較低，酶解κ-酪蛋白速率較慢，導致G′變化緩慢[21]；當溫度>25 ℃時，不同溫度條件下2種凝乳酶體系的G′均隨時間的延長先上升，達到最大值后下降；在30、35、40、45、50 ℃條件下，商品酶體系G′的峰值分別為116.81、269.01、191.09、109.11、55.06 Pa，到達峰值的時間分別是2 760、2 710、1 438、967、594 s；地衣芽孢桿菌凝乳酶體系G′的峰值分別為145.06、232.91、187.03、142.06、42.35 Pa，到達峰值的時間分別是1 981、1 103、832、649、568 s。這說明，隨著凝乳溫度的上升，凝乳時間提前，2種酶體系的最大G′不斷下降，其中，地衣芽孢桿菌體系比商品酶體系的凝乳時間分別提前了779、1 607、606、318、26 s。當溫度>40 ℃后，2種酶體系的G′下降迅速，這是由于隨著時間的延長，凝乳酶活力下降，且過高的溫度還會導致添加凝乳酶后立即凝乳，使凝乳酶混合不均勻，影響凝乳效果，與黃東旭等[23]的研究結果基本一致。

a-商品酶體系；b-地衣芽孢桿菌凝乳酶體系圖3 不同溫度條件下儲能模量G′的變化Fig.3 Change of storage modulus inenzyme coagulation process under different temperature

2.4 持水力變化

持水力越大，說明體系中束縛水含量越多[24]。由圖4可知，2種酶作用下，體系持水力均隨溫度的上升呈先上升后下降的趨勢。當凝乳溫度為25、30、35 ℃時，商品酶體系的持水力為87.82%、94.00%、97.33%，地衣芽孢桿菌體系的持水力為87.64%、91.70%、93.34%，2種酶體系的持水力均顯著上升(P<0.05)；當凝乳溫度為40、45、50 ℃時，商品酶體系的持水力為91.64%、90.48%、88.06%，地衣芽孢桿菌體系的持水力為92.33%、90.85%、90.36%，2種酶體系的持水力均顯著下降(P<0.05)，由此得出，當溫度>40 ℃時，2種酶體系的持水力隨溫度升高逐漸減小，這可能是溫度超過了凝乳酶的最適作用溫度，蛋白質膠束的網狀結構被破壞，水合作用降低，形成的凝塊收縮脫水，與孫金威等[25]的研究結果基本一致。

圖4 不同溫度條件下持水力的變化Fig.4 Change of water-holding capacity under different temperature

2.5 乳清OD值的變化

乳清OD值是凝乳過程中排出乳清的吸光值，乳清OD值越小，表示乳清中蛋白質量分數越低。由圖5可知，在25、30、35、40、45、50 ℃條件下，商品酶體系的乳清OD值分別為0.224、0.281、0.340、0.348、0.413、0.422，說明商品酶體系的乳清OD值隨溫度升高顯著增大(P<0.05)；地衣芽孢桿菌酶體系的乳清OD值分別為0.231、0.360、0.372、0.384、0.462、0.479，說明地衣芽孢桿菌凝乳酶體系的乳清OD值隨溫度升高顯著增大(P<0.05)。在不同溫度條件下，地衣芽孢桿菌凝乳酶體系的乳清OD值均大于商品酶體系。據雒亞洲等[26]研究表明，隨著溫度的升高，凝塊收縮的速度加快并伴有乳清析出。當溫度>40 ℃時，乳清OD值迅速增大，這是由于溫度過高使凝乳酶失活嚴重，與AMARO-HERNANDEZ等[27]的研究結果一致。

圖5 不同溫度條件下乳清OD值的變化Fig.5 Change of whey OD value under different temperature

2.6 溫度對凝乳微觀結構的影響

圖6為激光共聚焦顯微鏡下呈現的不同溫度下凝乳的微觀結構。由圖6可知，在30 ℃條件下形成的2組凝塊蛋白微粒聚集緊密，孔隙較?。?0 ℃條件下，2組凝塊蛋白微粒聚集的更加明顯，蛋白微粒間交叉連接更多，網絡結構的孔隙更小；50 ℃條件下，孔隙明顯比其他溫度下的樣品更多、更大，說明蛋白微粒間的相互作用加強，結構呈緊縮狀態。這是由于蛋白微粒間的相互作用強烈依賴于溫度[28]，高溫下，疏水相互作用增強導致蛋白微粒收縮[29]，與范金波等[30]的研究結果基本一致。在30和40 ℃條件下，商品酶組比地衣芽孢桿菌凝乳酶組蛋白微粒聚集的更緊密，孔隙更?。欢敎囟冗_到50 ℃時，商品酶組的網絡結構比地衣芽孢桿菌組的孔隙大，結構更疏松。

a、d-30℃地衣芽孢桿菌凝乳酶、商品酶凝乳的微觀結構； b、e-40℃地衣芽孢桿菌凝乳酶、商品酶凝乳的微觀結構； c、f-50℃地衣芽孢桿菌凝乳酶、商品酶凝乳的微觀結構 圖6 不同溫度下凝乳的微觀結構Fig.6 Microstructure of curds at different temperatures 注：圖中紅色部分為被尼羅紅染色的乳蛋白，黑色部分即孔隙為水相

3 結論

本實驗在不同溫度條件下，比較分析了地衣芽孢桿菌D3.11凝乳酶與商品酶的凝乳性能情況。結果表明，在凝乳過程中，隨著凝乳溫度的升高，蛋白質之間的相互作用不斷增強，2種酶體系的黏度值逐漸增大，溫度較高時，長時間凝乳會導致體系黏度值下降；在30～45 ℃時2種酶體系的濁度隨溫度升高顯著增大(P<0.05)；在35和40 ℃條件下，OD值相近且不顯著(P>0.05)；流變學特性表明，隨著凝乳溫度的上升，2種酶體系的最大G′不斷下降，且商品酶體系比地衣芽孢桿菌體系的G′下降快；在35 ℃時2種酶體系的持水力均達到最大；2種酶體系的乳清OD值均隨溫度的升高而顯著增大(P<0.05)；微觀結構表明在40 ℃條件下，2種酶的凝乳效果最好，且商品酶組比地衣芽孢桿菌凝乳酶組蛋白微粒聚集的更緊密，孔隙更小。綜上所述，凝乳溫度在凝乳過程中，具有極其重要的作用，結合相關指標的測定情況可知，在實際的應用過程中，確定其最適溫度需結合多個角度的考量，可以考慮按一定比例將2種凝乳酶復配使用，以達到最佳的凝乳性能。