微孔側流免疫層析法檢測農產品中2, 4-二氯苯氧乙酸殘留

華彥濤，劉波，趙炫，尹凱丹，馬楠楠,2，袁利鵬*

1(廣東農工商職業技術學院，廣東 廣州,510665)2(廣東萬聯生物科技有限公司，廣東 廣州,510663)

2, 4-二氯苯氧乙酸是高效、內吸、具高度選擇性的除草劑和植物生長調節劑，被廣泛用于禾科類作用的除草劑、生長調節劑和水果保鮮劑[1]。近期浙江、江蘇等地監管部門在水果、豆芽中仍檢測出超標的2,4-二氯苯氧乙酸。相關毒理實驗研究表明，2,4-二氯苯氧乙酸作為作物的除草劑和蔬果保鮮劑，其過高的殘留會對人的神經系統、內分泌系統和免疫系統造成影響，具有潛在致癌性和致突變性[2-3]。在國家標準GB 2763—2019《食品中農藥殘留最大限量》中規定谷物、蔬菜和水果中2,4-二氯苯氧乙酸的最高殘留限量分別為2.0、0.5、1.0 mg/kg。

目前，國內對苯氧乙酸類激素的檢測方法主要有氣相色譜法[4]、氣相色譜-串聯質譜法[5-6]、高效液相色譜法(high performance liquid chromatography, HPLC)[7]、高效液相色譜-串聯質譜法(high performance liquid chromatography-mass spectrometry, HPLC-MS)[8-11]、分子印跡傳感器法[12]、拉曼光譜檢測法[13]和免疫檢測法[14-16]。色譜類儀器檢測方法準確率高、靈敏度好等優點，同時也存在設備昂貴、需專業人員、前處理要求高等不足。傳感器和拉曼光譜分析方法多停留在研究層次，實際應用率偏低。而基于抗原抗體特異性識別為基礎的免疫快速篩選方法，已經成為食品安全檢測方法的主流檢測方法[17-20]，與儀器方法互補使用。微孔側流免疫層析法(microwell lateral flow immunochromatography, mwLFIA)是一種類似于膠體金層析卡，但又存在差別的檢測方法[21]。其主要原理是：將待測物與標記免疫金抗體在微孔中充分結合，通過層析作用，固相載體的包被抗原會捕獲金標抗體而聚集顯色，待測物越多，結合的抗體約多，固相載體上的包被抗原結合的少，顯色不明顯，表明陽性，反之則為陰性。微孔的使用，使得金標抗體與樣品在微孔中首先接觸，充分反應，有效地解決了傳統的膠體金中抗原抗體反應不充分或競爭力弱而帶來的假陰性和靈敏度偏低的問題。目前微孔測流免疫層析法已經用于食品中抗生素類藥物、他達那非類藥物殘留的檢測[21-22]，但檢測苯氧乙酸類激素的mwLFIA還未見報道。

本研究利用采用活潑酯法制備了人工抗原，通過動物免疫獲得了針對2,4-二氯苯氧乙酸的特異性抗體。通過試驗條件優化，建立了靈敏度好，前處理簡單，檢測時間較短的mwLFIA，該方法能夠用于水果、蔬菜和谷物類苯氧乙酸類激素殘留的檢測，為農產品監管提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試劑

4-氯苯氧乙酸、2,4-二氯苯氧乙酸標準品、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，上海阿拉丁試劑有限公司；牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)、OVA和羊抗鼠IgG 抗體，美國Sigma 公司；硝酸纖維素膜，美國Ahlstrom 公司；吸水紙H-8和底板J-B6，基因有限公司；金標復溶液、緩沖液，廣州萬聯生物科技有限公司；其他試劑，廣州化學試劑公司。

1.2 儀器與設備

UV-3010紫外可見分光光度計，日本Hitachi 公司；HGS 510劃膜噴金機和HGS 201切條機，杭州峰航科技有限公司；膠體金免疫層析讀數儀，南京微測生物科技有限公司；LC-15C液相色譜儀，島津(上海)商貿有限公司；5417R高速離心機，德國Eppendorf 公司；氮吹儀，康寧科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 抗體制備

采用活潑酯法將2,4-二氯苯氧乙酸與載體蛋白BSA 偶聯作為免疫原，載體蛋白OVA偶聯得到包被原(圖1)，采用紫外掃描法進行鑒定，-20 ℃凍存。將鑒定成功的免疫原，免疫雌性新西蘭大白兔，制備多克隆抗體。通過辛酸硫酸銨沉淀法純化抗體，并于-20 ℃凍存。

圖1 免疫原與包被原的制備Fig.1 Preparation of immunogen and coating antigen

1.3.2 制備納米金

（二）病理變化 剖檢見腹腔有少量黃色或淡紅色腹水，漿膜表面有出血斑點。剖檢變化主要發生在肝臟，肝臟色黃腫大，質脆，嚴重的有灰黃色壞死灶，小葉中心出血和間質明顯增生，質地變硬，膽囊萎縮，膽汁少而濃。大腿前和肩下區的皮下肌肉內發生出血，其他部位也常見肌肉出血，胃底彌漫性出血，有的出現潰瘍，腸道有出血性炎癥，胃腸道中有血凝塊，腎臟腫脹，蒼白或淡黃色，全身淋巴結腫脹，充血。脾臟通常無變化 ，心外膜和心內膜有明顯出血，脂肪黃染，有時結腸漿膜呈膠樣浸潤，通過對臨床癥狀和剖檢病理變化的分析，初步懷疑是霉玉米引起的黃曲霉素中毒。再做實驗室診斷。

采用氯金酸-檸檬酸三鈉還原法制備膠體金。取99 mL蒸餾水置于500 mL燒瓶中，加入1 mL 1%的氯金酸溶液，加熱至沸騰并持續1 min后，迅速加入1.5 mL 1%檸檬酸三鈉溶液，觀察溶液顏色，當溶液變為紅色并逐步穩定后，再繼續加熱3 min后冷卻、備用。制備好的膠體金紫外掃描鑒定，確定最大吸收峰波長，觀察吸收峰的峰形和峰寬。

1.3.3 納米金抗體標記條件優化

納米金與抗體結合是基于靜電吸附作用，這種吸附穩定性與標記溶液pH密切相關。若納米金溶液的pH不合適，反應后的金溶液不穩定易聚集沉淀，只有在合適pH，標記抗體效率最高，結合物較穩定。實驗利用0.1 mol/L K2CO3溶液調節納米金溶液的pH 值分別為7.5、8.0、8.5、9.0和9.5，各加入適量抗體進行振蕩10 min標記，再加入20 μL 10% BSA溶液振蕩15 min封閉，10 000 r/ min 離心15 min后棄上清液，加入等體積復溶液，裸眼觀察復溶情況，測定各復溶液在525 nm 處的吸光值，將易復溶、吸光值最高的復溶液的pH 值作為最佳標記pH 值。

1.3.4 標記抗體濃度優化

在標記過程中，抗體用量少，則難以復溶，如果用量過多，會造成資源浪費。在已確定pH 值的納米金溶液中加入適量抗體(1.0 mg/mL)，終質量濃度分別為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 μg/mL，振蕩孵育10 min 后，加入 10% BSA溶液 封閉10 min，離心后棄上清液，觀察復溶情況和525 nm 吸光值，選擇維持納米金溶液為紅色的最低抗體濃度為最佳抗體標記濃度。

1.3.5 金標抗體用量和包被原濃度的優化

標記抗體與包被原濃度的平衡對方法的建立至關重要。若金標抗體的含量過多，會導致假陰性，反之會造成假陽，都會降低方法的靈敏度。因此本研究通過棋盤法找出兩者之間最優組合。分別將包被抗原稀釋1、2、3、4倍，金標抗體稀釋2、3、4、5倍，同時檢測0.2 mg/kg的2,4-二氯苯氧乙酸標準品，根據層析卡的檢測線(T線)和質控線(C線)變化找出最優組合。

將羊抗鼠IgG分別稀釋成1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL，利用劃膜機，劃膜于C線，用膠體金免疫層析讀數儀讀數并輔助肉眼觀測顏色，并與已優化好的T線顏色對比，選擇出最適羊抗鼠濃度。

1.3.7 試紙條的組裝和金標微孔的制備

免疫層析卡包括樣品墊、硝酸纖維素膜(NC膜)、吸水紙和PVC 底板，檢測線和質控線分別為包被抗原和羊抗鼠IgG 抗體。金標抗體用量按照上述優化后的條件加入96 孔板的微孔，振蕩均勻37 ℃烘干過夜，密封干燥保存。

1.3.8 測定步驟及結果判定

吸取100 μL緩沖液于金標微孔內，室溫孵育8 min后，將試紙條垂直插入微孔，反應6 min。裸眼觀察判斷：T 線和C 線顯色相近或T線大于C線時時，結果均判定為陰性；T線不顯色或顏色稍淺于C線時，結果判定陽性或弱陽性；C線無色，試紙條判定為失效(圖2)。

圖2 微孔側流免疫層析試紙條的結構與實驗原理示意圖Fig.2 Structure and principle of the microwell lateral flow immunochromatography strip

1.3.9 樣品前處理

將待測的芒果、豆芽等蔬菜水果切成碎片，置于打碎機中打碎，分析天平稱取10 g 樣品置于50 mL離心管中, 加入20 mL的乙腈, 漩渦振蕩渦旋3～5 min充分混合，渦旋儀將固液混合物充分混勻, 室溫10 000 r/min 離心5 min；取1 mL上清液至10 mL潔凈干燥玻璃管中，水浴氮氣流下吹干；加入1 mL復溶工作液，渦旋振蕩1 min，待測。

2 結果與分析

2.1 人工抗原的鑒定

利用紫外光譜，分別掃描人工抗原、載體蛋白和2,4-二氯苯氧乙酸，如圖3所示。從掃描結果分析，與載體蛋白和2,4-二氯苯氧乙酸相比，人工抗原的特征吸收峰位移或峰型發生一定變化，表明2,4-二氯苯氧乙酸共價偶聯至載體蛋白表面。通過競爭抑制實驗，表明抗血清對藥物和包被抗原有特異性識別反應，證明人工抗原合成成功，從而獲得了特異性抗體。

a-免疫原；b-包被原圖3 人工抗原的紫外光譜掃描圖Fig.3 Ultraviolet absorption spectra of artificial antigens

2.2 納米金的制備

制備的膠體金溶液澄清無沉淀，顏色呈酒紅色；通過紫外掃描發現，膠體金溶液在521 nm附近存在特征吸收峰，峰形越窄顆粒越均勻(圖4)。

圖4 膠體金溶液紫外掃描圖Fig.4 Absorption spectrum image of synthesized gold nanoparticles

2.3 標記溶液pH的選擇

利用0.1 mol/L K2CO3溶液調節納米金溶液的pH 值分別為7.0、7.5、8.0、8.5和9.0，通過觀察及紫外掃描溶液在521 nm處的吸光值選擇最適的pH值，如圖5-a所示。隨著標記溶液pH值增大，其吸光值先增大后減小。當溶液的pH值為8.5時，膠體金的顏色最為鮮艷、明亮，吸光值也達到最大。

2.4 標記抗體濃度的選擇

將原始質量濃度為5.0 mg/mL的抗體在1 mL的膠體金溶液中分別加入不同體積(2、4、6、8、10 μL)來優化標記過程中抗體用量，如圖5-b所示。當標記用抗體逐漸增加時，標記抗體后納米金溶液由藍紫色逐漸變為酒紅色，且離心后沉淀易復溶，溶液的吸光值則先增大后減小。在加入6 μL時，膠體金上清顏色和沉淀復溶效果最好，因此8 μL/mL為標記抗體的最佳用量，即40 μg/mL。

a-pH 值；b-抗體濃度圖5 AuNPs 溶液pH 值及抗體濃度優化Fig.5 Optimization of pH value of AuNPs solutionand concentration of antibody

2.5 金標抗體用量和包被原濃度的選擇

根據實驗1.3.4的棋盤方法優化得到的結果如表1所示，不論是檢測陰性和200 ng/mL 2，4-二氯苯氧乙酸，隨著稀釋倍數的增加，層析卡T線顏色逐漸變淺。當金標抗體稀釋3倍、包被抗原稀釋2倍時，此時試紙條的陰性和陽性T線對比最明顯，不會存在金標抗體過剩或不足的現象，因此選擇金標抗體稀釋3倍、包被抗原稀釋2倍(1 mg/mL)。

表1 金標抗體與包被原濃度的棋盤優化Table 1 Chessboard optimization of concentration of gold labeled antibody and coating antigen

2.6 C線二抗質量濃度選擇

將羊抗鼠IgG分別稀釋成1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL，劃膜機劃出C線，搭配已經選擇好的金標抗體的量和包被抗原的質量濃度，檢測陰性樣品(0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液)，對比T線和C線的比值(T/C)在約≤1的時候較為合適，結果如圖6所示，二抗質量濃度在2.0 mg/mL時最佳。

圖6 質控線二抗濃度優化Fig.6 Optimization of the concentration of goat anti-mouse

2.7 方法的檢測限及特異性

把經HPLC確定的陰性的水果樣品溶液，加入1 mg/mL的2,4-二氯苯氧乙酸、4-氯苯氧乙酸和2,4,5-三氯苯氧乙酸等結構類似物，使2,4-二氯苯氧乙酸的終質量濃度分別為0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 μg/mL，4-氯苯氧乙酸的終質量濃度為0.01、0.02、0.05、0.10、0.20 μg/mL，2,4,5-三氯苯氧乙酸的終質量濃度為0.1、0.2、0.4、0.6 μg/mL。按照最優條件進行層析卡檢測。通過觀察T線和C線，判定結果的陰陽性。同時檢測2,4-二氯苯氧乙酸結構類似物，計算交叉反應率，判斷mwLFIA方法的特異性。結果如圖7和表2所示，mwLFIA方法的檢測限(消線值)為0.05 μg/mL，其結構類似物 4-氯苯氧乙酸為0.2 μg/mL，2,4,5-三氯苯氧乙酸為0.5 μg/mL，同時具有檢測時間短、操作簡單、特異性好的優點。

表2 mwLFIA方法的檢測限及特異性Table 2 Limit of detection and specificity of mwLFIA

圖7 mwLFIA方法的檢測限及特異性Fig.7 Limit of detection and specificity of mwLFIA

2.8 實際樣品分析

分別向陰性的芒果中，添加2,4-二氯苯氧乙酸，使添加質量濃度分別為0.01、0.05、0.10、0.25 μg/mL，同時按照確定好的樣品前處理方法處理在周邊不同商店購買的番茄(S1、S2)、豆芽(S3、S4)、芒果(S5、S6)和柑橘(S7、S8)等未知樣品，使用mwLFIA和HPLC同時測定。在標準品的添加實驗中，經HPLC確證，mwLFIA的靈敏度未受影響，為0.05 μg/mL。mwLFIA對實際未知樣品檢測陰陽性符合率與HPLC的結果一致，結果如表3和圖8所示，說明本研究建立的針對2,4-二氯苯氧乙酸的mwLFIA方法能夠用于實際樣品的檢測。

表3 mwLFIA實際樣品分析結果Table 3 The determination results for sample by mwLFIA and HPLC

圖8 mwLFIA實際樣品分析結果Fig.8 The determination results for sample by mwLFIA and HPLC

3 結論

本研究制備了識別2,4-二氯苯氧乙酸的特異性抗體，建立了蔬菜和水果中2,4-二氯苯氧乙酸殘留檢測的mwLFIA 方法,并且能夠同時檢測其結構類似物，其中2,4-二氯苯氧乙酸的消線值為0.05 μg/mL，4-氯苯氧乙酸的消線值為0.2 μg/mL，2,4,5-三氯苯氧乙酸的消線值為0.5 μg/mL，實際樣品的分析檢測結果與與HPLC法檢測結果一致。本方法前處理簡單，靈敏快速，適用于蔬菜和水果中2,4-二氯苯氧乙酸殘留現場快速篩查。