雙模態改良型酶聯免疫吸附測定法用于黃曲霉毒素B1的檢測研究

張光胤，蔡愛麗，鄧放明，趙倩*，石星波

1(食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，湖南 長沙，410128)2(湖南農業大學 食品科學技術學院，湖南 長沙，410128)

由真菌毒素引起的食品安全已成為人們高度關注的熱點問題。其中以黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)污染最為嚴重，其毒性、致癌性、致突變性、致畸性在所有真菌毒素中最強[1-4]，并容易污染谷物，乳制品，水果和飼料[5]。許多國家都規定了AFB1的限量標準，例如，歐盟對AFB1的要求低至2 μg/kg[6]。我國對食品中AFB1也采取了嚴格的限量標準，例如，花生、玉米及其制品中的AFB1≤20 μg/kg；糧食、豆類、發酵食品及調味品中的AFB1≤5 μg/kg；乳制品及嬰兒配方食品中AFB1≤10 μg/kg[7]。目前食品中AFB1的主要檢測方法包括液相色譜-質譜法[8-9]、高效液相色譜法[10]、免疫色譜法[11-12]、時間分辨免疫熒光分析技術[13-14]。雖然這些分析法具有較好的準確度和良好的重復性，但仍存在著耗時、靈敏度低、需要復雜昂貴的檢測儀器和專業操作人員的缺陷，在基層和現場無法被廣泛應用。因此，建立一種簡便、快速、靈敏的檢測方法顯得尤為重要。

酶聯免疫吸附檢測方法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)作為應用最廣的方法之一[15]，在食品質量控制領域引起了廣泛的關注[16-17]。但是，由于ELISA依賴抗體捕獲目標物，成本較高，且只能達到中等靈敏度(μg/mL～ng/mL)，無法滿足痕量目標物的檢測[18]。至今為止，研發人員已利用納米材料具有較大的比表面積、易于化學修飾、高負載能力的優點[19-20]，通過納米材料作為載體來富集酶提高了ELISA的靈敏度[21-23]。盡管使用納米材料改良ELISA已擁有可觀的前景，但仍無法滿足便攜和現場檢測的需求。

核酸適配體(aptamer，Apt)是由TUERK等[24]創建的指數富集的配體系統進化技術從DNA數據庫里篩選出來可特異性識別靶標物質的核酸序列。相對于抗體而言，Apt的特異性更強、穩定性更高且更易于合成和修飾，特別適合作為小分子的生物識別元件[25-26]。研究表明，Apt技術可提高檢測的敏感度和特異性[27]，并且Apt和抗體的組合也顯示出了良好的特異性[28-29]。

我們設計了一種雙模態改良型ELISA，用于AFB1的高靈敏便攜式檢測。使用親和素化的磁納米顆粒(magnetic nanoparticles，MNPs)作為載體，富集辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)，同時偶聯生物素化的AFB1Apt制備檢測探針(MNPs@Apt@HRP)。通過Apt與抗體組合共同識別目標物，以HRP催化H2O2氧化無色底物TMB成為藍色的ox-TMB，經過808 nm激光照射后ox-TMB還可發生很強的光熱效應使溶液溫度升高。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

AFB1標品(分析純),美正生物科技有限公司。TMB(分析純)、磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline，PBS),北京索萊寶科技有限公司。H2O2(30%)、檸檬酸(分析純)、醋酸鈉(分析純)、乙二胺四乙酸二鈉(分析純),國藥集團化學試劑有限公司。AFB1Apt序列(5′-3′)為：GTT GGG CAC GTG TTG TCT CTC TGT GTC TCG TGC CCT TCG CTA GGC CC[27]，由上海生工生物工程有限公司合成。

Heraeus Pico 17離心機，賽默飛世爾科技公司產品；TCS-10金屬恒溫振蕩器，杭州瑞誠儀器有限公司產品；Spark多功能酶標儀，瑞士帝肯公司產品；LSR808H-7 W-FC808激光器，吉藤電子科技有限公司產品；ELISA試劑盒，美正生物技術有限公司產品。

1.2 MNPs@Apt@HRP檢測探針的制備

將MNPs(12 μL，0.1 mg beads/mL)，AFB1Apt(12 μL，100 μmol/L)和HRP(12 μL，0.1 g/L)混合后，使用PBS稀釋至1.2 mL，25 ℃ 孵育40 min，10 000 r/min離心8 min，并用超純水洗滌3次除去多余HRP與AFB1適配體，洗滌后加入1.2 mL的PBS重懸，得到MNPs@Apt@HRP檢測探針，4 ℃保存備用。

1.3 探針的制備優化及驗證研究

取0.1 μL MNPs(10 mg beads/mL)與12 μL HRP(0.1 g/L)，加入PBS緩沖液稀釋至1 mL。25 ℃條件下分別孵育10、20、30、40、50 min后，10 000 r/min離心8 min，分別取上清液10 μL，加入等體積的TMB和H2O2，避光反應30 min，使用多功能酶標儀檢測A652nm。

分別取10 μL HRP和50 μL H2O2;10 μL HRP和50 μL TMB;50 μL TMB和50 μL H2O2;10 μL HRP，50 μL TMB和50 μL H2O2作為對照組。然后分別取100 μL MNPs，50 μL TMB和50 μL H2O2;100 μL MNPs@Apt@HRP，50 μL TMB和50 μL H2O2作為實驗組(使用的HRP質量濃度為0.1 g/L)。避光反應30 min。觀察溶液的顏色變化，檢測A652nm(每組3個平行)。然后使用808 nm激光照射4 min。立即將便攜式溫度計插入溶液中，檢測溶液溫度變化。插入溫度計探頭約5～8 s后獲得的最高穩定值為光熱測量信號。

1.4 探針調控比色信號研究

分別取100 μL質量濃度為5×10-3、2×10-3、1×10-3、6×10-4、3×10-4、1×10-4、6×10-5、3×10-5g/L的MNPs@Apt@HRP加入到50 μL TMB和50 μL H2O2溶液中，避光反應30 min。觀察溶液的顏色變化，并檢測A652nm。

1.5 基于比色與熱雙模態改良型ELISA檢測方法的建立

1.5.1 AFB1標準曲線的繪制

利用MNPs@Apt@HRP檢測探針與抗體的組合識別96孔聚苯乙烯微板上的一系列濃度的AFB1。具體步驟如下：

(1)AFB1抗體包被：向微孔板中加入100 μL 10 g/L AFB1抗體，4 ℃過夜；

(2)封閉：棄去液體，甩干，并用0.01 mol/L PBS緩沖液洗滌3次，加入200 μL牛血清白蛋白(BSA，0.001 g/L)進行封閉，37 ℃下避光孵育1 h；

(3)加入AFB1標準溶：棄去液體，甩干，用0.01 mol/L PBS緩沖液洗滌3次，分別加入質量濃度為1×10-5、1×10-6、1×10-7、1×10-8、1×10-9、1×10-10、1×10-11、1×10-12g/L的AFB1標準溶液，25 ℃ 下避光孵育30 min(每個濃度3組平行)；

(4)加入MNPs@Apt@HRP探針：棄去液體，甩干，用0.01 mol/L PBS緩沖液洗滌3次，向孔中加入200 μL MNPs@Apt@HRP探針溶液，25 ℃下避光孵育30 min。

(5)加入底物：棄去液體，甩干，用0.01 mol/L PBS緩沖液洗滌3次，加入100 μL PBS緩沖液，50 μL TMB和50 μL H2O2，然后避光于25 ℃孵育30 min。

拍照記錄每個孔中溶液顏色的變化，檢測溶液的A652nm并進行光熱免疫測定，記錄得到的雙模態信號分別繪制AFB1檢測的標準曲線。

1.5.2 比色與熱雙模態改良型ELISA的特異性研究

分別選取7種結構類似于AFB1的化合物，包括棒曲霉素(patulin)、黃曲霉毒素B2(aflatoxin B2，AFB2)、T-2毒素(trichothecenes，TS)、伏馬毒素B1(fumonisin B1，FB1)、玉米赤酶烯酮(zearalenone，ZEN)、赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)及混合樣品，測試該方法的特異性。AFB1的質量濃度為10-7g/L；干擾毒素的質量濃度為10-6g/L。在相同條件下，檢測溶液的雙模態信號變化。

1.6 幾種常見食品中AFB1的檢測

1.6.1 比色與熱雙模態改良型ELISA

1.6.1.1 樣品的前處理

(1)牛奶：取1 mL樣品，加入3 mL超純水，混合均勻；加熱至沸騰10 min；立刻以10 000 r/min離心10 min，取上清液備用。

(2)花生：將樣品粉碎，取5.0 g置入100 mL錐形瓶中，加入40%甲醇25 mL混合均勻；振蕩10 min(200 r/min)；以4 000 r/min離心5 min；取上清液1 mL，再加入4 mL去離子水；搖勻，備用。

(3)醬油：取5.0 g樣品，加入10 mL乙腈溶液，振蕩10 min(200 r/min)后，4 000 r/min離心5 min；取0.5 mL上清液，加入4.5 mL超純水；搖勻，備用。

(4)醋：取1 mL樣品，加入4 mL甲醇，振蕩均勻后，4 000 r/min離心5 min；取1 mL上層液體，加入9 mL超純水，將混合液的pH調節至7～8；搖勻，備用。

1.6.1.2 牛奶樣品中加標回收率檢測

取1 mL牛奶前處理的上清液，加入一定量的AFB1標準溶液，使上清液中AFB1的終質量濃度分別為1×10-7、1×10-8、1×10-9g/L(做3組平行)。根據上文中所述實驗過程，完成牛奶樣品中AFB1的檢測，并計算回收率。

1.6.1.3 樣品中AFB1含量的檢測

將本文建立的比色與熱雙模態改良型ELISA用于檢測花生、牛奶、醬油和醋4種樣品中AFB1的含量，并與商業化試劑盒檢測結果進行對比分析，驗證該檢測方法的準確性及可靠性。

1.6.2 商業化ELISA試劑盒

為了驗證新建方法的準確性，采用商業化ELISA試劑盒進行 AFB1檢測，具體操作見試劑盒說明。

2 結果與分析

2.1 比色與熱雙模態改良型ELISA檢測AFB1的原理

圖1展示了比色與熱雙模態改良型ELISA檢測AFB1的原理。在聚苯乙烯微孔板上包被AFB1抗體，MNPs@Apt@HRP為檢測探針。當AFB1存在時，通過Apt和抗體的組合識別并捕獲AFB1，形成“三明治”結構。以TMB和H2O2作為顯色底物，待檢物濃度的改變會導致探針濃度的不同，從而影響底物TMB顏色的改變，實現對AFB1的可視化檢測。再通過808 nm激光照射之后，ox-TMB產生的光熱效應導致溶液溫度升高，以便攜式溫度計實現對AFB1的熱信號便攜檢測。AFB1濃度越大，偶聯的探針越多，ox-TMB顯色越明顯；溫度升高越多。相反，如果沒有目標分子或者很少，檢測探針被沖洗掉后，無比色及溫度信號產生。通過ox-TMB的A652nm與經過808 nm激光4 W/cm2功率密度照射2 min后的溫度變化，實現了對AFB1的雙模態信號檢測。

圖1 基于比色與熱雙模態改良型ELISA用于AFB1 檢測的原理示意圖Fig.1 Schematic diagram of high-sensitivity detection of AFB1 based on colorimetric and thermal bimodal improved ELISA

2.2 探針制備的優化

HRP催化TMB氧化生成ox-TMB是信號產生的關鍵因素，為了探索最佳的實驗條件，我們研究了MNPs與HRP結合時間(10、20、30、40、50 min)對探針的影響。MNPs與HRP結合完畢后離心分離游離的HRP，取離心后的上清液進行顯色反應。通過比較A652nm可以獲得MNPs與HRP的最佳結合時間。如圖2所示，結合時間達到40 min時，曲線趨勢趨于穩定，ox-TMB的顏色不再產生明顯變化，此時MNPs與HRP的結合效率較高。因此，選擇40 min作為MNPs與HRP的結合時間。

圖2 不同時間MNPs與HRP結合離心后上清液中HRP 催化生成ox-TMB的吸光度值Fig.2 The absorbance value of HRP catalyzed to produce ox-TMB in the supernatant after centrifugation of MNPs and HRP at different times 注：插圖為不同時間對應的比色照片

2.3 HRP修飾情況與實驗可行性的驗證

HRP成功修飾在MNPs的表面，并且MNPs不影響顯色反應是該方法建立的前提。本文探究了不同情況下TMB和H2O2顯色反應，以此考察HRP在MNPs上的修飾情況與MNPs對顯色反應的影響(圖3)。

如圖3-a所示，只有HRP，TMB和H2O2都存在的情況下，溶液會從無色變為藍色，MNPs@Apt@HRP，TMB與H2O2都存在的情況下，也發生了顏色變化，表明MNPs@Apt@HRP成功催化TMB氧化生成ox-TMB，而單獨的MNPs無法催化TMB產生明顯的顏色變化。由此可證明，HRP已在MNPs的表面成功修飾。

a-驗證HRP修飾情況的可見光光譜；b-不同反應溶液的溫度變化； c-時間對溫度變化的影響圖3 實驗可行性的驗證Fig.3 Verification of experimental feasibility

同樣，使用4 W/cm2的808 nm激光輻照2 min，測試光熱效應，輻照后立即使用便攜式溫度計測量溶液的溫度。如圖3-b所示，觀察到MNPs@Apt@HRP，TMB與H2O2都存在的體系中溫度升高了13.9 ℃，在TMB、MNPs+TMB、HRP、HRP+H2O2、TMB+H2O2的體系中輻照后未發現明顯的溫度升高。說明808 nm激光不會催化TMB氧化生成ox-TMB，而且熱信號的產生是因為ox-TMB受到輻照后將光信號轉變為熱信號。這些結果證明了MNPs@Apt@HRP探針介導的比色與熱雙模態改良型ELISA具備可行性。

為了確認輻照時間，使用808 nm激光持續照射3 min。使用便攜式溫度計連續監控溫度變化。如圖3-c所示，照射時間在0～150 s時，溫度隨時間的增加而增大，當時間達到150 s時，溫度趨于穩定，當時間>150 s時，溫度不再發生明顯改變。因此，在隨后的免疫分析研究中，以150 s作為照射時間。

2.4 MNPs@Apt@HRP對ox-TMB生成量的影響

微孔板中捕獲MNPs@Apt@HRP的量是否對生成的ox-TMB濃度有影響是比色與熱雙模態改良型ELISA完成對不同濃度AFB1檢測的關鍵。本文研究了不同濃度的MNPs@Apt@HRP對ox-TMB生成量的影響，結果如圖4所示。在3.91×10-6～5×10-3g/L，隨著探針濃度增加，觀察到混合液從無色到藍色的趨勢，并且探針質量濃度為5×10-3g/L時A652nm的增加最為明顯。表明隨著檢測探針濃度的增加，可產生更高濃度的ox-TMB，微孔板中捕獲的探針的量與ox-TMB比色信號的產生成正相關。

圖4 不同濃度的MNPs@Apt@HRP與TMB和H2O2 相互作用的可見光光譜Fig.4 Visible spectra of the interaction of different concentrations of MNPs@ATP@HRP with TMB and H2O2 注：插圖為不同濃度MNPs@Apt@HRP對應的混合液照片

2.5 比色與熱雙模態改良型ELISA用于AFB1的檢測

在最佳條件下，研究了比色與熱雙模態改良型ELISA用于AFB1檢測的靈敏度。如圖5-a所示，當AFB1的質量濃度為1×10-5～1×10-11g/L時A652nm與AFB1濃度的對數呈現良好的線性關系，回歸方程為A=0.047 1 lgc+0.757，線性相關系數R2=0.990 4(圖5-b)。圖5中插圖可用于定性或半定量分析。當AFB1的質量濃度達到1×10-12g/L時，A652nm幾乎不再發生明顯改變，檢測靈敏度達到2.47×10-12g/L。

a-可見光光譜；b-標準曲線圖5 不同濃度的AFB1可見光光譜和標準曲線Fig.5 The visible spectra of AFB1 with different concentrations and standard curve 注：插圖為不同濃度AFB1對混合液的顏色影響的照片

使用熱信號對AFB1進行定量檢測，結果如圖6所示。當AFB1質量濃度為1×10-8～1×10-12g/L時，溫度升高與AFB1濃度的對數呈線性相關，回歸方程為ΔT=1.57 lgc+28.72，線性相關系數R2=0.991 6，檢測靈敏度為3.79×10-13g/L。因此，通過使用便攜式溫度計可實現對AFB1的高靈敏定量檢測。

圖6 熱信號檢測AFB1的標準曲線Fig.6 Standard curve of thermal signal detection AFB1

2.6 比色與熱雙模態改良型ELISA用于AFB1檢測的特異性

使用比色與熱雙模態改良型ELISA分別測定了質量濃度為1×10-6g/L的干擾毒素(TS、OTA、AFB2、patulin、ZEN、FB1、DON)來進行免疫檢測特異性研究。結果如圖7所示，在檢測7種干擾毒素時，既沒有觀察到干擾毒素產生明顯的吸光度變化，并且無明顯的溫度信號產生。而在檢測低質量濃度AFB1(1×10-7g/L)時可觀察到A652nm出現明顯吸收峰，溫度信號也有明顯的升高。此外，測定混合液時，觀察到比色與溫度信號與單獨檢測AFB1時幾乎沒有變化。這些結果證明了即使存在高濃度干擾物質，比色與熱雙模態改良型ELISA仍具有較高的特異性。

a-比色信號；b-熱信號圖7 檢測AFB1的特異性分析Fig.7 Specificity analysis of AFB1

2.7 方法實用性結果研究

為了驗證比色與熱雙模態改良型ELISA在實際樣品中的適用性，我們采用標準加入法對牛奶樣品中的AFB1含量進行了檢測。我們在商業化ELISA試劑盒未檢測到AFB1的牛奶樣品中加入不同濃度的AFB1標準品，使樣品中的AFB1終質量濃度分別為1×10-7、1×10-8、1×10-9g/L。檢測結果如表1所示，基于比色與熱信號的測結果與加入的理論值相比，二者基本保持一致。基于雙模態信號的檢測回收率分別為99.07%～100.82%；100.74%～102.12%，相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)分別為1.03%～2.55%；1.13%～2.84%。結果證明了該方法在實際樣品檢測中具有良好的實用性和準確性。

表1 比色與熱雙模態改良型ELISA測定牛奶中 AFB1的回收率Table 1 Colorimetric and thermal bimodal improved ELISA to determine the recovery rate of AFB1 in milk

按照2.8中所述商業ELISA試劑盒中的使用方法檢測不同質量濃度的AFB1標準溶液(0、0.03、0.12、0.48、2 μg/L)。檢測結果如圖8 所示，隨著AFB1濃度的增大，A652nm逐漸降低。當AFB1質量濃度為0.03～2.00 μg/L，AFB1濃度與A652nm呈明顯線性關系，線性方程為A=-0.108 6 lgc+0.144 4，其中R2=0.994 9，檢測靈敏度為1.7×10-3g/L。本文中的雙模態改良型ELISA比色性檢測AFB1的靈敏度為2.47×10-12g/L，熱信號對AFB1的檢測靈敏度達到3.79×10-13g/L，分別比商業化試劑盒提高了3個和4個數量級。

a-可見光光譜；b-標準曲線圖8 ELISA試劑盒的可見光光譜和標準曲線Fig.8 The visible spectra and standard curve of ELISA Kit

之后，我們用購買的ELISA試劑盒和設計的比色與熱雙模態改良型ELISA方法分別對花生、牛奶、醬油、醋4種樣品中的AFB1進行了檢測。如表2所示，試劑盒檢測出牛奶中AFB1的濃度與2種信號檢測出的結果基本保持一致，因此設計的改良型ELISA方法與ELISA試劑盒檢測結果具有一致性。試劑盒在花生、醬油、醋中未檢出AFB1。而比色信號與熱信號檢測到的花生，醬油和醋中AFB1的濃度基本一致，可見該方法實用性良好。盡管已檢測到一定量的AFB1，但遠遠低于國家要求的≤5 μg/L，仍在安全范圍內。

表2 比色與熱雙模態改良型ELISA檢測樣品中的 AFB1含量 單位：g/L

3 結論

本文采用MNPs作為載體來富集HRP和AFB1Apt制備檢測探針，Apt與抗體組合作為識別元件，以TMB的顯色反應與ox-TMB的光熱效應為信號輸出，構建了比色與熱雙模態的改良型ELISA，實現了AFB1的可視化比色及便攜式溫度信號的高靈敏及高特異性檢測，檢測靈敏度分別達到了2.47×10-12、3.79×10-13g/L。與商業化ELISA試劑盒相比, 靈敏度分別提高了3個和4個數量級。最后，將該方法成功應用于牛奶，花生，醋和醬油中AFB1的檢測。適配體與抗體的組合捕獲目標物相比試劑盒的競爭性結合更穩定、易修飾，且相較使用兩個抗體形成三明治結構的ELISA成本更低。因此，該方法能夠滿足痕量檢測AFB1的需求，在食品檢測領域具有良好的應用前景。