分光光度計比濁法測定乳酸桿菌脅迫存活率

徐倩，付瑞燕

(安徽農業大學 茶與食品科技學院，安徽 合肥，230036)

大量研究表明，能夠作為人類胃腸道中益生菌的乳酸桿菌具有抗氧化、降低膽固醇、增強免疫力、抗腫瘤等重要生物學功能，其廣泛應用于食品、農業和醫藥等行業[1-3]。但是在工業應用中，乳酸桿菌會面臨多種物理或化學脅迫作用，如膽鹽脅迫、酸脅迫、氧脅迫、冷凍脅迫等，進而影響細胞的許多重要生理功能，降低細胞的活力，制約著相關產品的開發[4-5]。在環境脅迫中，乳酸桿菌的細胞活力受到損傷，受損傷程度與其自身抗性大小密切相關，抗性越強的細胞越能耐受工業生產過程，維持細胞活力，從而在最終產品中表現出其相應的作用。因而，改善乳酸桿菌的環境脅迫抗性具有很高的實際應用價值，近年來選育具有多種脅迫抗性乳酸桿菌菌株的研究受到廣泛關注[6-8]。脅迫抗性一般是基于對細胞生死狀態的鑒別來進行表征的。目前，國內外主要采用稀釋平板菌落計數法測定活菌數量(CFU)從而計算脅迫抗性[9]，該法主要是通過梯度稀釋使菌懸液中的細胞充分分散后，接種平板培養，形成肉眼可見的菌落，假定每個菌落是1個活細胞形成的，計算得到活菌數量。此方法操作要求較高，如在稀釋時需要充分混勻菌液，否則人為造成的誤差較大[10]。近年報道的流式細胞計數可區分未受損、受損和受脅迫細胞[11]，但是對受損和受脅迫細胞數量的測定并不能完全表征出細胞經脅迫后繁殖力損傷的多少，而經脅迫后細胞具有多少殘存繁殖力對于工業應用是非常必要的，如經胃酸脅迫后細胞如能快速恢復繁殖力，則有助于其在體內定殖，因而需要對有生長能力的乳酸桿菌細胞進行計數。比濁法通過培養液的吸光度(濁度)來間接表示細胞生長情況，是國內外通用的方法。本研究擬采用比濁法測定2種供試的乳酸桿菌菌株(發酵乳桿菌415和植物乳桿菌LGD)經脅迫后再培養的生長特性，并研究該法與稀釋平板菌落計數法測定結果的相關性，來探究用比濁法測定乳酸桿菌脅迫存活率的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗菌株及培養基

發酵乳桿菌415和植物乳桿菌LGD由安徽農業大學茶與食品科技學院食品微生物實驗室保藏。所用培養基為MRS培養基。

1.1.2 儀器與設備

SW-CJ-2FD超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；DK-8D數顯恒溫水浴鍋，江蘇金怡儀器科技有限公司；PHS-3C pH計，上海雷磁；752紫外可見分光光度計，上海精密科學儀器有限公司；SPX-150B-Z生化培養箱，上海博迅實業有限公司；HYQ—3110漩渦混合器，上海珂淮儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發酵乳桿菌415酸脅迫生物量比曲線的測定

將活化后的對數期發酵乳桿菌415用生理鹽水將濁度(OD600)調整至4.0，以5%的接種量轉接至MRS培養基中，37 ℃下靜置培養至穩定期，取5 mL發酵液離心(8 944×g, 5 min)去上清液，將細胞沉淀重懸于pH 2.3的鹽酸溶液中，37 ℃下水浴30 min后，離心(8 944×g, 5 min)去上清液，用生理鹽水洗滌菌體1次，重懸于等量的生理鹽水中，以5%的接種量接種至20 mL MRS培養基中，37 ℃下靜置培養，每隔1 h取樣測定生物量(OD600)，得到OD脅，對照組用生理鹽水代替鹽酸溶液，其余處理與實驗組一致，得到OD對。每組設3個平行樣。生物量比=OD脅/OD對。

1.2.2 不同酸脅迫時間下比濁法測定生物量比曲線和稀釋平板計數法測定存活率

用1.2.1同樣的方法將發酵乳桿菌415在pH 2.3的鹽酸溶液中、37 ℃下分別水浴15、50、100、150、180 min 后，取5 mL發酵液離心(8 944×g, 5 min)去上清液，生理鹽水洗滌后重懸于等量的生理鹽水中，用稀釋平板計數法測定菌懸液存活率，并以5%的接種量將菌懸液接種至20 mL MRS培養基中，37 ℃下靜置培養，根據脅迫程度在合適的時間取樣測定生物量(OD600)，對照組用生理鹽水代替鹽酸溶液，其余處理與1.2.1的一致，得到不同酸脅迫條件下生物量比曲線。

酸脅迫存活率的測定：取經酸脅迫且重懸于生理鹽水的菌懸液，用混勻器充分混勻，進行梯度稀釋，吸取10 μL 稀釋菌液在MRS固體培養基上點樣，每個稀釋度點5個平行，待表層菌液被吸收后，放入37 ℃培養箱，倒置培養至菌落長出，對每個稀釋度平板進行菌落計數，同時以重懸于生理鹽水條件下的菌懸液作為對照，計算存活率。存活率=脅迫后的菌落數/對照菌落數。計算存活率時，考慮了誤差的傳遞。誤差傳遞公式為：

(1)

式中：A，脅迫后的菌落數；ΔA，脅迫后的誤差；B，對照的菌落數；ΔB，對照的誤差；C，存活率；ΔC，存活率誤差。

1.2.3 酸脅迫標準方程對于發酵乳桿菌415其他類型脅迫存活率測定的適用性

膽鹽脅迫：將經生理鹽水洗滌的發酵乳桿菌415重懸于0.001%(質量分數)膽鹽溶液中37 ℃下水浴45、90 min，其他操作方法與酸脅迫一致。

H2O2和NaCl脅迫：分別將經生理鹽水洗滌的發酵乳桿菌415在室溫下重懸于500 mmol/L H2O2溶液中45、60、90 min以及400 mmol/L NaCl溶液中60、80 min，其他操作方法與酸脅迫一致。

冷凍脅迫：將經生理鹽水洗滌的發酵乳桿菌415重懸于等量滅菌生理鹽水中，分裝于無菌離心管中，取出適量菌懸液作為對照組，其余的置于-20 ℃下，分別于第0.5、2天取出在室溫解凍作為脅迫組，其他操作方法與酸脅迫一致。

以上脅迫實驗均用稀釋平板菌落計數法測定存活率，計為存活率真值，用分光光度計比濁法測定生物量比，獲得存活率擬合值。

1.2.4 比濁法測定植物乳桿菌LGD脅迫存活率

將活化后的對數期植物乳桿菌LGD用生理鹽水將濁度(OD600)調整至4.5，在pH 2.5鹽酸溶液中分別脅迫0.5、1、2.5、3、4 h后，用1.2.2中的方法測定取樣時間點的生物量比和存活率之間的線性相關，獲得酸脅迫標準曲線，用酸脅迫、H2O2脅迫和膽鹽脅迫實驗來驗證這個酸脅迫標準方程的適用性，酸脅迫條件是37 ℃，pH 2.5的鹽酸溶液中水浴3.5 h以及pH 2.7的鹽酸溶液中水浴1 h；膽鹽脅迫的條件是37 ℃下0.001%膽鹽溶液中水浴40、100 min；H2O2脅迫條件是室溫下在200 mmol/L H2O2溶液中水浴30、90 min。以上脅迫實驗均用稀釋平板菌落計數法測定存活率，計為存活率真值，用分光光度計比濁法測定生物量比，獲得存活率擬合值。

2 結果與分析

2.1 經酸脅迫的發酵乳桿菌415的生長性能

在各種環境脅迫中，乳酸桿菌經常面臨的脅迫是酸脅迫，其在發酵生產以及在人體胃液中都會遭遇酸脅迫的影響。乳酸桿菌屬于嗜中性微生物，當處于較低pH值的環境條件下時，高濃度的H+會損傷細胞膜上的蛋白，從而影響營養物質的跨膜轉運；環境pH過低也會使細胞內pH值隨之降低，影響細胞中多種對酸敏感的酶活性，細胞糖降解速率降低，影響細胞能量的產生，從而限制菌體本身的生長和代謝。如圖1所示，當發酵乳桿菌415在pH 2.3條件下脅迫30 min后重新接種新鮮MRS培養基，與對照組(未脅迫)相比，其生長曲線延滯期明顯延長。微生物延滯期的長短與許多因素有關，在菌種、培養基和培養條件相同條件下，延滯期的長短主要與接種量密切相關。因此，經過酸脅迫后，部分發酵乳桿菌415細胞活性受到嚴重損傷，失去繁殖的能力，活細胞數減少，將脅迫后的菌液接種新鮮培養基后，其生長曲線會有相應的響應。由脅迫組和對照組的生物量比值繪制得到的生物量比曲線呈現出先下降后上升的特點，在4 h時生物量比最低，可能的原因是對照組在4 h 時已進入對數期，而脅迫組在4 h時還處于延滯后期，導致此時脅迫組與對照組生物量比值最低，隨著培養時間的延長，脅迫組開始快速生長，導致脅迫組與對照組生物量的比值開始增加。

圖1 發酵乳桿菌415經pH 2.3鹽酸溶液脅迫30 min的 生物量曲線和生物量比曲線Fig.1 Biomass curve and biomass ratio curve of Lactobacillus fermentum 415 under 30 min acidic stress in pH 2.3 HCl solution

從圖1可以看出，生物量比曲線谷底后1 h(即第5 h)的生物量比值與培養物中活細胞數量可能成正相關，即此時培養體系中活細胞數越多，在5 h時脅迫組的生物量越高，那么生物量比值就會越高，該點定為取樣時間點。為驗證這一推測，分別測定了發酵乳桿菌415經pH 2.3鹽酸溶液脅迫15、50、100、150、180 min的生物量比曲線和細胞存活率。實驗發現(圖2)，當脅迫程度較高時(即酸脅迫時間較長)，生物量比曲線上谷底出現的時間會比脅迫程度較低的延遲，谷底也沒有那么明顯，即出現1個低谷期而不是1個低谷值。結合生物量曲線，表明脅迫時間越長，菌懸液中活細胞數越少，因而在再培養過程中延滯期延長，取樣時間點因此往后延遲，脅迫組的生長速率因此減慢，在取樣時間點后的生物量比值增幅也因此減小，從而形成低谷期。

a-脅迫15 min;b-脅迫50 min;c-脅迫100 min;d-脅迫150 min;e-脅迫180 min圖2 發酵乳桿菌415經pH 2.3鹽酸溶液脅迫不同時間的生物量曲線和生物量比曲線Fig.2 Biomass curves and biomass ratio curves of L.fermentum 415 under different duration of acidic stress in pH 2.3 HCl solution

以存活率為橫坐標，不同脅迫條件下生物量比曲線谷底后1 h(取樣時間點)的生物量比值作為縱坐標，即經pH 2.3鹽酸溶液脅迫15、50、100、150、180 min再接種培養的第4、6、6、6、8 h的生物量比值，繪制存活率與生物量比之間的關系曲線，對其進行回歸分析(圖3)，結果顯示，在存活率為0.06～0.85時，兩者的相關系數達到0.997 1，而其他時刻生物量比與存活率之間線性相關不顯著(數據未顯示)。因而此方程可作為標準方程，即發酵乳桿菌415經酸脅迫后用比濁法得到的生物量比代入此方程，即可得到存活率值。驗證實驗顯示，在兩次酸脅迫實驗中，酸脅迫后存活率分別為0.156±0.054和0.347±0.067的菌懸液取樣時間點的生物量比值分別為0.199±0.006和0.363±0.011，代入此方程后，計算所得的擬合存活率分別為0.161和0.322，存活率真值與擬合值之間的誤差率為-3.54%和7.09%，均小于10%，表明比濁法測定酸脅迫存活率具有良好的可靠性。

圖3 發酵乳桿菌415取樣時間點的生物量比 和存活率之間的線性關系Fig.3 Linear relationship between biomass ratio and viability of L.fermentum 415 under acidic stress at sampling point

2.2 比濁法酸脅迫標準方程測定不同脅迫類型存活率的適用性

乳酸桿菌會面臨各種不同類型的脅迫[12-13]，并且脅迫損傷機理差異較大，例如膽鹽會破壞細胞膜的完整性，降低胞內pH[14]；冷凍脅迫會使某些蛋白質折疊速率減緩或低效，降低細胞膜流動性等，從而劇烈干擾細胞的正常代謝[15]。為評價前述得到的比濁法酸脅迫標準方程是否可以用于測定其他類型脅迫存活率，將發酵乳桿菌415分別經H2O2脅迫、膽鹽脅迫、冷凍脅迫和NaCl脅迫，測定生物量比和存活率，將取樣時間點的生物量比值代入酸脅迫標準方程求得擬合存活率，將擬合存活率與真值結果進行比較，結果如表1所示，兩者之間的誤差率均小于10%，表明比濁法測定不同脅迫類型存活率具有良好的可靠性。可見，該標準方程不是只能用于酸脅迫，而是基于待測菌液中存活的細胞數，不論這些殘存的活細胞是經過怎樣的脅迫(物理的或化學的)，只要是存活的，可能就適用這個標準方程。

表1 分光光度計比濁法酸脅迫標準方程測定發酵乳桿菌 415不同類型脅迫下存活率的驗證性實驗Table 1 Validation experiments of the standard equation for acidic stress by the turbidimetric assay using spectrophotometer to determine the viability of L.fermentum 415 under different type of stress

2.3 比濁法測定植物乳桿菌LGD脅迫存活率

為驗證比濁法是否可以應用于測定其他乳酸桿菌脅迫存活率，下面以植物乳桿菌LGD為研究對象，建立其酸脅迫標準方程，結果如圖4所示，將植物乳桿菌LGD經pH 2.5脅迫不同時間，存活率為0.098～0.803，比濁法測定結果與稀釋平板法之間線性關系良好，R2=0.998 7。相比發酵乳桿菌415，其存活率線性范圍較窄，可能是因為植物乳桿菌的對數期(7 h)比發酵乳桿菌(9 h)的短，因而當脅迫程度較大時，脅迫組延滯期剛結束，對照組已進入穩定期，這樣對照組生物量會包含部分死細胞，就會偏離生物量比與存活率之間的線性相關。用酸脅迫、H2O2脅迫和膽鹽脅迫實驗來驗證這個酸脅迫標準方程，結果如表2所示，存活率真值與擬合值之間的誤差率均小于10%，表明比濁法可以用來準確測定植物乳桿菌LGD酸脅迫、H2O2脅迫和膽鹽脅迫存活率。

圖4 經酸脅迫的植物乳桿菌LGD取樣時間點的 生物量比和存活率之間的線性關系Fig.4 Linear relationship between biomass ratio and viability of L.plantarum LGD under acidic stress at sampling point

表2 分光光度計比濁法酸脅迫標準方程測定植物 乳桿菌LGD不同類型脅迫下存活率的驗證性實驗Table 2 Validation experiments of the standard equation for acidic stress by the turbidimetric assay using spectrophotometer to determine the viability of L.plantarum LGD under different type of stress

3 討論與結論

比濁法常用于抗生素的抑菌性能研究，但報道大多以優化指示菌初始濃度、培養時間等因素，使抗菌物質濃度的對數與濁度在一定范圍內線性關系良好，從而確定比濁法測定抑菌活性的方法[16]。而本課題組前期已建立的分光光度計比濁法測定細菌素乳酸鏈球菌素、類細菌素NFL和抗生素硫酸慶大霉素這3種抗菌物質效價[17]，是找到了抗菌劑效價線性定量測定的關鍵因子，即取樣時間點，從而使抑菌率與抗菌物質濃度之間直接建立線性關系。與本文所報道的方法不同，其取樣時間點是以抑菌率最高時對應的培養時間為取樣時間點。

FERRANDO等[5]研究了NaCl濃度對于植物乳桿菌生長性能的影響，在20 h的培養期內每隔30 min 取樣1次，測定濁度OD570，計算出最大比生長速率(μmax)，從而可以得到各個實驗組之間在存活率上的差異。該法需要多次取樣，工作量較大，并且實驗結果無法與稀釋平板菌落計數法之間相關聯，因而無法與他人的研究結果相比較。對于需要測定一個乳酸桿菌菌株多種脅迫抗性的研究而言，本文所建立的分光光度計比濁法測定脅迫存活率是一個有效的方法，只需測定該菌株一種脅迫的比濁法標準曲線回歸方程并驗證其他類型脅迫的適用性后，就可以通過測定生長曲線來獲得標準曲線存活率范圍內不同脅迫程度下的存活率值。這不僅可以減少由于稀釋操作不可避免帶來的較大誤差，還可以減少檢測時間。以植物乳桿菌LGD為例，比濁法測定樣品存活率所需時間最多為7 h，與稀釋平板菌落計數法需要48 h相比，檢測所用時間明顯縮短，具有一定的優勢，從而有利于實現乳酸桿菌脅迫抗性的快速準確檢測。