復合乳酸菌發酵酸乳貯藏期穩定性及其風味物質的研究

王磊，宗麗娜，高宗露，魯茂林，王文瓊，陳大衛，徐粉林，顧瑞霞*

1(江蘇省乳品生物技術與安全控制重點實驗室(揚州大學)，江蘇 揚州，225127)2(維維食品飲料股份有限公司，江蘇 徐州，221000)

乳酸菌是工業上重要的細菌之一，廣泛應用于發酵食品工業，尤其是酸乳的生產。酸乳是最受歡迎的發酵乳制品之一，通常使用嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)和德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)復合發酵[1]，其中徳氏乳桿菌保加利亞亞亞種可以在發酵過程中通過同型乳酸發酵將乳糖轉化為乳酸，并且將蛋白質降解為肽類和氨基酸，從而為乳制品提供特有的質地、風味，同時賦予乳制品特殊的益生功效以及營養價值[2]。嗜熱鏈球菌在酸乳發酵前期產酸、產黏等方面發揮著重要作用[3-4]，產酸能力強的嗜熱鏈球菌有助于提高酸奶產品產酸速率、縮短發酵時間，從而提高生產效率、降低酸乳生產成本[5]，并且有研究表明兩者在發酵過程中表現出共生的關系[6-8]，因此，將兩者進行共發酵有利于提升發酵劑的整體性能。國內外學者對發酵乳中的風味物質進行了大量研究，但對發酵乳制品貯藏過程中產生的風味物質研究很少。發酵乳制品中含幾百種含量較低的風味物質，固相微萃取(solid phase microextraction，SPME)法和氣相色譜-質譜(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)聯用技術是目前發酵乳制品風味研究中較為常見的研究手段。

酸乳發酵劑是酸乳生產的核心技術，但目前我國酸乳發酵劑中90%以上來自于國外生產。因此，篩選出優良的發酵劑菌株至關重要。本文將不同發酵特性的嗜熱鏈球菌和德氏乳桿菌保加利亞亞種進行復合發酵，測定其單一及復合菌株發酵酸乳的發酵性能和貯藏期穩定性，并結合感官評價及SPME-GC-MS對單菌株及復合菌株發酵的酸乳貯藏前后風味物質變化進行檢測分析，以期為酸乳發酵劑的優化設計提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 實驗材料

MRS肉湯、M17肉湯，青島海博；脫脂乳粉、全脂乳粉，新西蘭威士蘭乳業公司；瓊脂、甘油、吐溫-80、NaCl、HCl、NaOH，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 實驗材料

嗜熱鏈球菌HST-6、嗜熱鏈球菌HST-9和德氏乳桿菌保加利亞亞種KDB-1，揚州大學江蘇省乳品生物技術與安全控制重點實驗室。

1.1.3 儀器與設備

Trace ISQ氣相色譜質譜聯用儀，美國Thermo公司；DB-5MS弱極性色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 um)，美國安捷倫公司；手動固相微萃取進樣手柄、50/30 μm DVB/CAR on PDMS萃取頭，上海安普實驗科技股份有限公司；SX-500蒸汽滅菌鍋，日本TOMYG公司；SW-CJ-1F超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；GYB60-08高壓均質機，上海東華高壓均質機廠；PL2002電子天平，梅特勒公司；HH6恒溫水浴鍋，國華電器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的活化及全脂乳的制備

1.2.1.1 菌株活化

將凍干保藏管中的嗜熱鏈球菌和德氏乳桿菌保加利亞亞種接種于MRS/M17液體培養基中，在平板中劃線，挑選單菌落培養，按照3%的接種量轉接活化2次，然后按照3%的接種量接種于12%(質量分數)脫脂乳培養基中，待凝乳后，于4 ℃保藏備用。

1.2.1.2 全脂乳的制備

將蒸餾水預熱至50 ℃，加入12%(質量分數)全脂乳粉混勻，待溫度上升至60 ℃時，加入質量分數為6.5%的蔗糖溶解攪拌，使其充分混合，過200目篩，均質(18～21 MPa，循環2次)，95 ℃熱處理10 min，冷卻至4 ℃備用。

1.2.2 樣品的制備

將德氏乳桿菌保加利亞亞種KDB-1、嗜熱鏈球菌HST-6、HST-9、德氏乳桿菌保加利亞亞種與2種嗜熱鏈球菌等比例組成的2菌株復合發酵劑HST-6+KDB-1(組合1)、HST-9+KDB-1(組合2)和3菌株等比例復合發酵劑HST-6+HST-9+KDB-1(組合3)，以5×106CFU/mL的添加量接種于滅菌后的全脂乳培養基中，42 ℃水浴10 min后，立即置于42 ℃培養箱中恒溫發酵，觀察其凝乳情況，并對菌株發酵完成及貯藏期間各時間點(貯藏0、1和14 d)取樣，用于后續各項發酵特性指標的測定。

1.2.3 相關指標的測定

1.2.3.1 發酵時間的確定

將活化好的菌株以5×106CFU/mL的添加量接種到全脂乳培養基中，于42 ℃條件下恒溫發酵，每隔2 h測定1次樣品的pH和酸度。待樣品pH降低到4.60～5.00，記錄發酵完成時間。

1.2.3.2 活菌數的測定

乳酸菌活菌數的測定參考GB 4789.35—2016《食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》[9]。

1.2.3.3 滴定酸度的測定

滴定酸度的測定參考GB 5009.239—2016《食品安全國家標準 食品酸度的測定》[10]。稱取5 g酸乳樣品，記錄質量m，用40 mL蒸餾水稀釋，并加酚酞指示劑，用0.1 mol/L的NaOH滴定至微紅色，30 s內保持不變色，記錄消耗的NaOH滴定量V，按公式(1)計算樣品酸度：

(1)

1.2.3.4 pH值的測定

采用pH計測定酸乳樣品的pH。

1.2.3.5 黏度的測定

酸乳樣品到達發酵終點后，冷卻至4 ℃，采用PV-Ⅱ黏度儀測定酸乳樣品的黏度。

1.2.3.6 持水力的測定

參照參考文獻[11]的研究方法。取12 g酸乳樣品于15 mL離心管中，記錄質量M1，2 000 r/min離心20 min，去除上清液，記錄質量M2，按公式(2)計算樣品持水力：

(2)

1.2.3.7 揮發性風味物質測定

分析采用SPME-GC-MS聯用技術參照參考文獻[12]測定酸乳發酵貯藏前后揮發性風味物質，取10 mL 酸乳樣品于15 mL氣相瓶中置于4 ℃冷藏備用。

(1)色譜條件：載氣為He，流速1.0 mL/min；不分流進樣，進樣口溫度250 ℃。程序升溫方式，起始溫度為35 ℃，保持5 min后以5 ℃/min的速率上升至140 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min的速率上升至250 ℃，保持3 min。

(2)質譜條件：全掃描模式，EI離子源，電子能量70 eV，離子源溫度為230 ℃，質量掃描范圍(m/z)：35～500 amu，無溶劑延遲。

(3)SPME萃取條件：萃取頭老化：于250 ℃進樣口老化30～60 min；固相微萃取條件：50 ℃磁力攪拌器上吸附60 min；解吸附條件：250 ℃條件下解吸附3 min。

(4)定性與定量分析：利用隨機攜帶Masshunter工作站NIST 2.2標準庫自動檢索各組分質譜數據，利用面積歸一化法計算各組分相對峰面積比(即每種風味物質組分峰面積占離子色譜圖中所有風味物質總峰面積的百分比)。

1.2.3.8 感官評價

表1為酸乳感官評價標準。挑選10名接受過專業感官分析培訓的學生組成評價組，分別對發酵酸乳進行感官評價。

表1 酸乳感官評價標準Table 1 Sensory evaluation standard of yoghurt

1.2.4 數據分析

試驗數據重復測定3次，以Mean±SD表示，采用Origin 2018軟件處理作圖，并采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析。P<0.05為顯著差異。

2 結果與分析

2.1 酸乳酸化曲線的測定

圖1為單菌株和組合菌株發酵過程中pH的變化。單菌株發酵時，嗜熱鏈球菌HST-6和HST-9發酵速率顯著高于德氏乳桿菌保加利亞亞種KDB-1，將嗜熱鏈球菌和德氏乳桿菌保加利亞亞種進行組合發酵的過程中，發現其組合在pH到4.6時的發酵速率較德氏乳桿菌保加利亞亞種單菌株發酵提高了近30%，這可能是由于發酵過程中嗜熱鏈球菌是主要的產酸菌株[13]。同時，組合菌株的發酵速率高于單菌株的發酵速率。這是由于嗜熱鏈球菌與德氏乳桿菌保加利亞亞種共發酵時存在協同作用，在發酵過程中德氏乳桿菌保加利亞亞種產生的多肽和游離氨基酸能夠進一步提高嗜熱鏈球菌的生長繁殖以及產酸的能力[2]。

圖1 單菌株和組合菌株發酵過程中pH的變化Fig.1 Changes of pH during fermentation from single strains and combined strains

2.2 酸乳發酵時間的確定

表2為單菌株和組合菌株酸乳發酵時間的測定結果。發酵時間是衡量優良酸乳發酵劑的一個重要指標，發酵時間過長可能會受到其他微生物的污染，同時在實際工業化生產過程中會造成生產成本的增加，降低效率，直接影響工廠實際經濟利益。單菌株和組合菌株發酵時間均在4.13～7.45 h，其中德氏乳桿菌保加利亞亞種KDB-1發酵時間為7.45 h，顯著高于其他菌株(P<0.05)，與嗜熱鏈球菌組合發酵可顯著縮短發酵時間，組合菌株發酵完成時酸度均>80 °T，顯著高于單菌株發酵時的酸度(P<0.05)。

表2 單菌株和組合菌株酸乳發酵時間的確定Table 2 Determination of fermentation time of yoghurt from single and combined strains

2.3 酸乳的貯藏穩定性測定

2.3.1 貯藏期間酸乳活菌數的測定

圖2為貯藏期間酸乳活菌數的測定結果。研究者認為活菌數>106CFU/mL就可以達到益生的效果[14]。貯藏14 d，單菌株和組合菌株均在108CFU/mL左右，呈一定上升趨勢，其中，組合3發酵酸乳的活菌數顯著高于其他菌株(P<0.05)，貯藏14 d后達到了10.25×108CFU/mL，這驗證了嗜熱鏈球菌與德氏乳桿菌保加利亞亞種共發酵時存在協同作用，德氏乳桿菌保加利亞亞種活菌數顯著低于其他菌株(P<0.05)，但貯藏期間活菌數上升最多，提高了5.13×108CFU/mL。

圖2 貯藏期間酸乳活菌數的測定Fig.2 Determination of the viable counts of yoghurt during storage 注：標注小寫字母表示不同樣品同一天之間的差異，大寫字母 表示同一樣品不同貯藏天數之間的差異(P<0.05)(下同)

2.3.2 貯藏期間酸乳酸度的測定

圖3為貯藏期間酸乳酸度的測定結果。眾所周知，菌株的產酸能力和其耐酸性不僅直接影響酸乳的風味和組織狀態，還會對酸乳中乳酸菌的活菌數產生影響，例如，酸化能力較強的菌株會導致酸乳過度酸化影響口感，酸化能力較弱會影響酸乳中風味物質的產生[15]。有研究表明，消費者能夠接受的酸乳酸度為70～110 °T[16]。不同菌株發酵的酸乳4 ℃貯藏期間酸度隨著貯藏期的延長而升高，除貯藏0 d時菌株KDB-1的酸度低于70 °T，其他菌株貯藏14 d期間酸乳的酸度均處于70～110 °T，處于消費者對風味接受度的范圍內。貯藏14 d后，菌株KDB-1發酵的酸乳酸度顯著增加，提高了24.62 °T，復合發酵時酸度上升幅度均高于單菌株HST-6和HST-9，這可能是因為酸乳在低溫貯藏期間，德氏乳桿菌保加利亞亞種為主要的產酸菌株[17]；同時由于復合菌株發酵時所含的德氏乳桿菌保加利亞亞種濃度相近，因此復合菌株發酵的酸乳產酸能力基本一致。

圖3 貯藏期間酸乳酸度的測定Fig.3 Determination of the acidity of yoghurt during storage

2.3.3 貯藏期間酸乳持水力的測定

圖4為貯藏期間酸乳持水力的測定結果。酸乳的持水力是影響乳清析出的重要因素之一，乳清析出主要是組成發酵乳凝膠網絡的顆粒在凝膠形成前和形成中的過度重排造成的[18]，它不僅受到多種流變學參數的影響，而且容易受到酸乳酸度和發酵溫度的影響[19]。大部分菌株的持水力為60%～90%，具有較好的持水能力，其中組合1和組合3貯藏14 d持水力分別為98.51%、96.52%，顯著高于其他菌株(P<0.05)，這表明這2種乳酸貯藏期間能保持較好的持水能力。部分菌株貯藏1 d后持水能力發生顯著性變化(P<0.05)，這可能是由于4 ℃貯藏期間酸度增加，影響了酸乳的膠體結構，導致其持水力的降低。

圖4 貯藏期間酸乳持水力的測定Fig.4 Determination of water-holding capacity of yoghurt during storage

2.3.4 貯藏期間酸乳黏度的測定

圖5為貯藏期間酸乳黏度的測定結果。黏度是衡量酸乳品質的重要因素，酸乳黏度主要是由于酸度的不斷下降而導致酪蛋白凝固，以及菌體分泌胞外多糖而使其呈現均一的黏稠狀[20]。在同一發酵條件下，選擇產黏性好的菌株能夠改善酸乳的組織狀態[21]，但黏度過高不利于工業化生產，因此綜合考慮，選擇黏度適中的菌株顯得尤為重要。隨著貯藏時間的延長，酸乳的黏度呈現先上升后下降的趨勢，貯藏1 d時，黏度達到最佳，其中菌株HST-6和組合1發酵的酸乳黏度最高達到20 000 MPa·s以上，不適用于工業化生產，菌株HST-9、組合2和組合3的黏度介于6 000～10 000 MPa·s，黏度較佳，且貯藏 14 d 黏度變化較為平緩。

圖5 貯藏期間酸乳黏度的測定Fig.5 Determination of the viscosity of yoghurt during storage

2.4 酸乳感官評價

圖6為專業人員對酸乳的感官評價結果。感官評價是評價酸乳品質的重要指標，通過感官評價不僅能反映出酸乳樣品間的差異，還能夠反映出消費人群的喜好和產品的受歡迎情況。單菌株發酵的酸乳感官評分顯著低于復合菌株發酵的酸乳(P<0.05)，菌株HST-6和菌株HST-9發酵速率較快，但發酵的酸乳黏度過高，且風味評分較低；而菌株KDB-1發酵的酸乳香味較好，但組織狀態較差，黏度較低。組合3發酵的酸乳的感官評分最高，色澤呈乳白色，具有典型的酸奶滋味和氣味，質地細膩均勻，酸甜黏度適中，貯藏14 d內品質穩定，無氣泡且無乳清析出。

圖6 專業人員對乳酸的感官評價Fig.6 Sensory evaluation of yoghurt

2.5 酸乳風味物質的分析

圖7為酸乳貯藏階段中揮發性成分總離子流圖。利用SPME法對單菌株HST-6、HST-9和KDB-1以及3菌株復合發酵的酸乳貯藏1和14 d的酸乳樣品進行風味物質富集，結合GC-MS對各樣品的揮發性風味物質進行檢測分析。

圖7 酸乳貯藏階段樣品中揮發性成分總離子流圖Fig.7 TIC of volatiles extracted from yoghurt samples during storage

表3為酸乳中揮發性風味物質的測定結果。酸乳制品都有其獨特的風味特性，這主要取決于所含的特征風味物質種類和含量[22]。風味物質的數量和種類與菌株分解代謝蛋白質、脂肪、乳糖的能力有關[23]。這些代謝產物對酸乳的風味及質地的形成有著重要的作用。通過GC-MS分析，共鑒定出108種揮發性化合物，主要分為7類，主要包括醛類、酮類、酸類、酯類、醇類、芳香族、烷烴類等化合物，從風味物質種類上來看，其中脂類、酮類、酸類、烷烴類化合物相對含量較高，為其主要風味物質，其他化合物相對含量較低。貯藏14 d后，脂類、酮類、醇類、烷烴類和酸類相對含量變化顯著，其中醇類，烷烴類化合物相對含量均顯著降低，HST-6、HST-9、KDB-1和組合3發酵的酸乳醇類化合物分別從7.74%、7.19%、16.30%、12.93%降至3.88%、1.72%、5.25%、2.09%，烷烴類化合物從11.41%、31.53%、9.27%、14.28%降至6.28%、9.67%、7.63%、9.67%。

表3 酸乳中揮發性風味物質的測定 單位：%

表4為酸乳中主要揮發性風味物質種類及相對含量的結果。HST-6、HST-9、KDB-1和組合3發酵的酸乳分別鑒定出58、48、62和63種風味物質，其中相對含量較高的化合物有2-庚酮、辛酸、乙偶姻、叔十六硫醇等，為主要的風味物質。

表4 酸乳中主要揮發性風味物質種類及相對含量 單位：%

在酸乳發酵過程中產生的酸類化合物主要來源于脂肪分解、蛋白質水解等代謝途徑[24]。酸類化合物在酸乳中發揮著重要作用，賦予酸乳特有的清爽風味[25]，酸乳中共檢測到15種酸類化合物，主要有辛酸、己酸、月桂酸和醋酸等。其中正己酸能為酸乳帶來香甜的干酪香氣，辛酸具有清香的風味[26]，其中HST-6、HST-9、KDB-1和組合3發酵的酸乳正己酸相對含量分別為9.87%、0.00%、9.78%、0.10%，貯藏14 d后為2.71%、4.13%、9.85%、2.45%，酸乳貯藏過程中正己酸相對含量除HST-6均呈上升趨勢、辛酸相對含量分別從2.44%、3.41%、2.44%、0.12%、上升到9.69%、2.45%、4.42%、3.74%。

酮類化合物多由不飽和脂肪酸的氧化、熱降解或微生物代謝產生，酮類化合物能賦予酸乳特有的風味[9]。4種酸乳中均檢測到了2-壬酮、2-庚酮、2，3-戊二酮、2-十一酮、乙偶姻等酮類化合物，貯藏14 d后酮類化合物相對含量顯著上升，酸乳中2-壬酮、2，3-戊二酮等相對含量較高，其中HST-6、HST-9、KDB-1和組合3發酵的酸乳2-壬酮相對含量分別從0.14%、0.18%、0.29%、0.66%上升到了14 d后的4.37%、9.21%、7.61%、4.52%，2-壬酮是關鍵的揮發性化合物，有助于酸乳的“奶油、新鮮”風味[27]。

酯類化合物是4種酸乳中相對含量最高的一類化合物，酸乳中醇類化合物與游離氨基酸結合可以形成酯類化合物，賦予酸乳呈現迷人的香味，同時可以有效減弱脂肪酸和胺類產生的苦味[23-24]，在4種酸乳中檢測到的脂類化合物相對含量較高，共檢測到了38種脂類化合物，其中，甲酸庚酯、丁位癸內酯、N-羥基苯甲酸甲酯等相對含量較高。

烷烴類化合物是酸乳中重要的風味化合物之一，大多數烷烴類化合物風味閾值較高，對發酵乳風味的影響不明顯，但一定濃度的烷烴類化合物可以豐富酸乳的口感[28]；酸乳中的醇類化合物可能與乳糖代謝、甲基酮還原、氨基酸代謝、亞油酸和亞麻酸降解等有關[29]，其中飽和醇的風味閾值較高，對整體風味貢獻較小，不飽和醇的風味閾值較低，對風味貢獻較大[30]；醛類化合物在酸乳風味化合物中占比較低，屬于微量香氣成分，但對酸乳風味構成有重要的影響[23]，貯藏期間4種酸乳中醛類化合物相對含量均顯著上升，其中HST-9、KDB-1和組合3發酵酸乳中壬醛相對含量分別從0.49%、0.65%、0.18%上升到2.54%、1.02%和1.47%，壬醛可以賦予酸乳水果香味，提高酸乳的整體風味。

3 結論

本研究采用具有不同發酵特性的嗜熱鏈球菌HST-6、HST-9與德氏乳桿菌保加利亞亞種KDB-1分別復合發酵，其中，菌株HST-6、HST-9與KDB-1這3種菌株復合發酵時，產酸速率最快，得到了具備3種菌株所有優良特性的酸乳，且產品酸甜適中，口感、風味優良，黏度適中，持水力強，同時貯藏期間各項指標穩定，品質最佳。通過SPME-GC-MS對單菌株及復合菌株發酵的酸乳貯藏前后的風味物質進行檢測分析，共檢測出108種揮發性風味物質，脂類、酮類、酸類和烷烴類含量相對較高，其中2-壬酮、2-庚酮、辛酸、乙偶姻、叔十六硫醇為主要的風味物質，貯藏14 d后，酮類化合物和脂類化合物的含量整體呈上升趨勢，醇類化合物和烷烴類化合物相對含量顯著降低。單菌株和復合菌株發酵的酸乳產生的揮發性化合物是不同的，包括一些已知的重要風味化合物的變化，這些風味化合物賦予不同酸乳制品特征風味。這些特征風味為生產具有特殊風味的酸乳制品的菌株選擇提供依據。初步斷定，菌株HST-6、HST-9與KDB-1 這3種菌株復合發酵劑可作為酸乳發酵劑進一步應用于酸乳制品生產加工過程。