肉桂醛促進即食牛肉中蠟樣芽孢桿菌熱失活的動力學模型

索標，常玉婷，王瑞，關鵬，艾志錄，范會平，黃忠民*

1(河南農業大學 食品科學技術學院，河南 鄭州，450002)2(農業農村部大宗糧食加工重點實驗室，河南 鄭州，450002) 3(國家速凍米面制品加工技術研發專業中心，河南 鄭州，450002)4(速凍面米及調制食品河南省工程實驗室，河南 鄭州，450002)

即食食品是一類以肉、蛋、糧食、蔬菜等為原料，根據消費者飲食需要加工制作而成，打開即可食用的食品[1]。然而，由于即食食品需要經過工業化生產，在加工、運輸、貯藏、銷售[2]等環節中易受到微生物污染[3-5]，因而需要在烹飪、包裝之后再進行嚴格的殺菌。近年來即食食品微生物超標導致食物中毒的現象不斷發生，對人們身體健康產生了很大的威脅[6]。

蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)在自然界分布廣泛[7]，能夠產生抗性極強的芽孢，當數量超過103CFU/g時即可能引起人嘔吐和腹瀉，從而對消費者健康造成威脅[8]。成都市市售食品中蠟樣芽胞桿菌污染達17.6%[9]，在豬肉[10]等食品中也檢測出較高的蠟樣芽孢桿菌污染率[11]，其中熟肉制品污染風險較高[12]。因此，如何保證即食食品的安全性，有效殺死即食食品中的蠟樣芽孢桿菌，已成為即食食品安全控制的重要問題。

即食食品的殺菌技術主要包括熱殺菌和非熱殺菌技術，非熱殺菌包含低溫等離子體、超高壓[13]和脈沖強光[14-15]等，但熱殺菌技術仍是目前最普遍和高效的殺菌方式。在食品生產中，高溫高壓殺菌會嚴重破壞食品的品質，影響口感。在食品中添加抗菌劑也是食品安全控制的重要手段之一，化學抗菌劑會產生一定的毒副作用，天然抗菌劑是從植物、動物或微生物中提取出來的天然無毒物質[16]，其中，肉桂醛是肉桂精油的主要成分，具有香味，是綠色安全的天然抗菌劑[17-18]，對金黃色葡萄球菌[19]、大腸桿菌[20]、李斯特菌[18]等食源性致病菌都具有良好的抑制作用。王舒叆等[21]研究了肉桂醛對蠟樣芽孢桿菌的抑制效果，發現肉桂醛是一種具有廣闊應用前景的天然抗菌劑，抑菌效果好于乳酸鏈球菌素。

隨著信息化的發展，預測微生物學發展迅速，通過建立數學模型可簡單快速地預測不同環境因子下致病菌的生長和失活規律，從而對食品的貨架期和殺菌效率進行有效預測[22]。雖然目前國內外學者使用預測微生物模型擬合蠟樣芽孢桿菌的生長曲線的研究已有報道[23]，但有關即食牛肉中蠟樣芽孢桿菌熱失活模型的研究尚未見報道。

本研究以即食牛肉為載體，研究不同低強度熱處理條件下，不同濃度的肉桂醛對蠟樣芽孢桿菌熱失活動力學的影響，建立其熱失活一級模型和二級模型，以期為即食食品安全控制技術的建立提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

肉膏蛋白胨肉湯(luria bertani，LB)、胰蛋白胨大豆瓊脂(tryptose soya agar，TSA)、平板計數瓊脂(plate count agar，PCA)、酵母浸粉(yeast extract，YE)、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)，北京路橋技術股份有限公司；氯化鈉(分析純)，天津市德恩化學試劑有限公司；肉桂醛(純度99%)，吉安市國光香料廠；蠟樣芽孢桿菌CMCC(B)63303，中國醫學微生物菌種保藏管理中心；牛肉糜、食鹽、味精,購自鄭州當地的雙匯超市。

1.2 儀器與設備

SX-500高壓蒸汽滅菌鍋，日本 Tomy 公司；JJ-CJ-1FD潔凈工作臺，蘇州凈化有限公司；MX-S混合儀，大龍興創實驗儀器有限公司；LHP-250智能恒溫恒濕培養箱，上海鴻都電子科技有限公司；TGL-16G高速臺式離心機，上海安亭科技儀器廠；移液槍(10～1 000 μL)，德國 Eppendorf 公司；SCIENTZ-11無菌均質器，寧波新芝生物科技股份有限公司；SHZ-82A水浴恒溫振蕩器，金壇醫療儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種保藏與菌懸液的制備

蠟樣芽孢桿菌CMCC(B)63303于-80 ℃的甘油管中保藏。在無菌條件下，將貯存的蠟樣芽孢桿菌接種到營養瓊脂平板(TSA+0.6%YE)上，37 ℃下培養10 h，挑取單菌落至無菌的肉湯培養基(LB+0.6%YE)中，150 r/min 37 ℃搖床上培養10 h至指數后期(約108～109CFU/mL)。放在4 ℃冰箱備用。

1.3.2 即食牛肉的制作

新鮮牛肉糜購自鄭州當地的雙匯超市，隨后立即保存在-30 ℃冰箱中，本研究選擇牛肉糜作為原材料，主要因為牛肉糜可作為預制菜肴產品的主要成分，且可以與抗菌劑均勻混合，從而充分發揮其作用。使用前，將牛肉解凍，使用紗布包裹，清水清洗3次，除去肉中血水，100 g的肉糜使用1 000 mL的鹽水進行煮制，加鹽量為5 g/L，味精為1 g/L，煮制時間為15 min。煮制結束后將肉粒撈出除去多余湯汁，盡快放入無菌自封袋中，放置無菌操作臺進行分裝，經PCA檢測細菌為陰性。

1.3.3 肉桂醛的添加和蠟樣芽孢桿菌的接種

語文教育是任何學科教育的基礎，它在學生素質培養中有不可估量的作用。語文課是工具性和人文性的統一，它的作用也可以從這兩個方面得到體現。

將煮好的牛肉糜在無菌操作臺中進行分裝，每個無菌均質袋裝10 g左右的牛肉糜，添加肉桂醛使其質量分數分別為0%、0.1%、0.5%、1.0%[18]。將兩者充分混勻后，再每袋添加100 μL菌液，使初始菌落數約為108CFU/g，進行充分攪拌，壓平，厚度為1 mm左右，袋內盡量不要有空氣，最后密封。

1.3.4 熱處理

將準備好的樣品放在預熱好的恒溫水浴鍋中進行熱處理，水浴的溫度分別為55、60、65、70 ℃，經過熱處理后立即放入冰水中降溫，并盡快進行計數。

1.3.5 蠟樣芽孢桿菌的計數

將處理后的樣品，在無菌條件下加入90 mL的0.85%無菌生理鹽水，以11 次/s拍打5 min。取100 μL菌懸液經梯度稀釋后，進行涂布，每個處理3個平行，放置在37 ℃培養。

1.3.6 數據處理與曲線擬合

使用Microsoft Excel 2016進行平均數、STDEV的計算和圖表的繪制。一級模型使用IPMP2013軟件進行曲線擬合。weibull模型如公式(1)所示：

(1)

式中：t為時間，Y0為初始菌落數，CFU/g；Y(t)為在時間t時的菌數，CFU/g；D和α為圖形參數。

二級模型是建立菌落數與溫度和濃度之間的關系。t5.0是菌落數降低5 lgCFU/g所需要的時間，可以用來評價殺菌效果[18]。多項式模型如公式(2)所示：

lnt5.0=a+b×(eΤ+fC)+c×(eΤ+fC)2+d×(eΤ+fC)3

(2)

式中：a、b、c、d、e、f均為模型參數;T為處理的溫度，℃；C為肉桂醛的濃度，%。

1.3.7 二級模型的評價

為了驗證建立模型的可靠性，使用準確度(Af)和偏差度(Bf)、均方根誤差(root mean squared error，RMSE)對預測值和實測值進行檢驗分析。Af的值越接近于1，說明準確度越高；Bf越趨近于1，說明模型的偏差度越小。RMSE表示模型的適用性，該值越接近于0，說明模型越適用[24]。表達式如公式(3)～公式(5)所示:

(3)

(4)

(5)

2 結果與分析

2.1 即食牛肉中蠟樣芽孢桿菌熱失活初級模型的建立

為了研究不同溫度下肉桂醛對即食牛肉中蠟樣芽孢桿菌熱失活的影響，選擇55、60、65、70 ℃這4個溫度進行研究，使用IPMP2013軟件對數據進行擬合，擬合結果如表1和圖1所示。誤差平方和(sum of squares due to error，SSE)、均方誤差(mean squared error，MSE)、RMSE和Residual stdev的值均接近于0，Af和Bf的值趨近于1，可以得出weibull模型對即食牛肉中蠟樣芽孢桿菌的熱失活曲線擬合效果好，準確度較高，能更好的預測蠟樣芽孢桿菌的熱失活規律。PEREIRA等[25]采用weibull模型對可可豆中蠟樣芽孢桿菌孢子的熱失活曲線進行了擬合，結果也表明該模型擬合效果較好。

表1 使用weibull模型模擬即食牛肉中蠟樣芽孢桿菌的 熱失活參數及菌落數降低5 lgCFU/g所需要的時間Table 1 Use the weibull model to simulate the heat inactivation parameters of B.cereus in ready-to-eat beef and the time required to reduce the number of colonies by 5 lgCFU/g

當肉桂醛濃度相同時，溫度越高，蠟樣芽孢桿菌的菌落數降低5 lgCFU/g所需要的時間越短。添加1%的肉桂醛與不添加肉桂醛的樣品相比，蠟樣芽孢桿菌的t5.0在55、60、65、70 ℃下分別減少了17、8.71、2.83、1.4 min。同時，在相同溫度下，肉桂醛的濃度越高，t5.0也逐漸減小，菌落數的降低速度越快，說明肉桂醛的使用降低了即食牛肉中蠟樣芽孢桿菌的熱抵抗能力。

a-55℃；b-60℃；c-65℃；d-70℃圖1 不同溫度下添加肉桂醛的即食牛肉中蠟樣芽孢桿菌的熱失活weibull模型擬合曲線圖Fig.1 Weibull model fitting curve of thermal inactivation of B.cereus in ready-to-eat beef with cinnamaldehyde at different temperatures

2.2 二級模型的建立

根據實驗數據，本研究采用多項式方程擬合了蠟樣芽孢桿菌的熱失活二級模型，擬合曲線如圖2所示。采用該多項式二級模型，也成功擬合了溫度和抗菌劑對金黃色葡萄球菌生長的影響規律[26]。將一級模型擬合所得到的參數帶入公式(2)中，得到二級模型的擬合公式： lnt5.0=-50.748+43.562×(0.058T+0.333C)-11.805×(0.058T+0.333C)2+1.026×(0.058T+0.333C)3。

天然抗菌劑肉桂醛主要通過破壞細胞結構，使內溶物流出導致細胞凋亡[27]。由圖2可知肉桂醛的質量分數越大，lnt5.0逐漸下降，不同溫度之間下降趨勢較為一致；隨著溫度的升高，lnt5.0呈現階梯式下降，溫度越高，lnt5.0的值越小，蠟樣芽孢桿菌的下降速率越快。本研究結果說明肉桂醛能明顯降低即食牛肉中蠟樣芽孢桿菌的熱抗性，提高殺菌效果。

2.3 二級模型的評價

通過計算RMSE、R2、Af和Bf判斷二級模型的擬合結果(表2)，R2、Af、Bf均接近于1，RMSE的值趨近于0，說明多項式方程擬合二級模型擬合的準確度較高，偏差度較小[28]。由圖3可知，殘差值呈正態分布的關系，說明多項式模型的擬合結果可靠，能較準確地預測一定溫度和肉桂醛條件下即食牛肉中蠟樣芽孢桿菌的熱殺菌動力學規律。

a-肉桂醛濃度；b-溫度圖2 溫度和肉桂醛濃度與lnt5.0的二級模型擬合圖Fig.2 Fitting diagram of temperature and cinnamaldehyde concentration with lnt5.0 secondary model

表2 多項式模型的擬合結果Table 2 Fitting results of polynomial models

圖3 殘差分布的驗證結果Fig.3 Validation results for residual distribution

3 結論

本研究分析了天然抗菌劑肉桂醛與熱殺菌技術結合對蠟樣芽孢桿菌的抑制效果，結果表明肉桂醛的使用降低了蠟樣芽孢桿菌對溫度的抵抗能力，能夠降低即食食品的熱殺菌強度，減少對食品品質的影響。并使用weibull和多項式方程分別建立一級和二級模型，并通過參數RMSE、R2、Af、Bf以及殘差分布圖評價模型擬合效果，所建立的低強度熱殺菌模型，可為即食食品安全控制技術的建立提供參考。