紫檀芪納米復合物的構建及穩定性研究

楊凡，朱玲，吳港城，齊希光，張暉

(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122)

紫檀芪(pterostilbene，PTS)是一種芪類化合物，主要存在于藍莓、葡萄等水果中[1]。研究表明，其是白藜蘆醇的甲基化衍生物，具有抗氧化、延緩衰老、降血脂等生物活性[2]。然而紫檀芪在水中的溶解性極差，導致其生物利用率低，在光照條件下容易轉變成順式結構而失去活性[3]，因而限制了其在醫藥、食品及保健品中的應用。

以納米輸送系統改善疏水性分子的溶解性和穩定性越來越受歡迎，尤其是利用蛋白質作為載體。蛋白質來源廣、成本低，而且具有多個疏水區域可以與活性物質結合，可用于穩定膠體顆粒或者納米分散體[4]。TAPAL等[5]制備了大豆蛋白-姜黃素復合物，姜黃素的溶解性以及生物利用率顯著提高。LIU等[6]利用乳清蛋白保護白藜蘆醇不被降解，提高了白藜蘆醇的穩定性。

亞麻籽蛋白具有較高的營養價值，其溶解性和乳化性良好，而且其熱穩定性優于大豆蛋白、乳清蛋白等[7]，可以作為活性物質的載體。但是其在等電點附近以及高鹽條件下不穩定，容易聚集。先前的研究表明，蛋白質與多糖(如：海藻酸鈉、大豆多糖等)可以通過靜電相互作用結合，從而有效抑制聚集體的產生，提高體系的穩定性[8]。

本文利用可溶性大豆多糖制備負載紫檀芪的亞麻籽蛋白-大豆多糖核殼型納米復合物，研究顆粒之間的相互作用以及復合物的穩定性，以期開發出用于醫藥及保健品領域的紫檀芪納米輸送體系。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

亞麻籽餅粉，寧夏君星坊食品科技有限公司；可溶性大豆多糖(soluble soybean polysaccharide，SSPS)，河南萬邦實業有限公司；紫檀芪(純度≥98%)，北京百靈威科技有限公司；其他試劑購于國藥集團化學試劑公司，均為分析純。

GL-23M冷凍離心機，長沙翔之離心機有限公司；LGJ-10E冷凍干燥機，寧波森茨生物科技有限公司；Nano-ZS粒度電位儀，英國馬爾文公司；傅里葉紅外光譜儀，美國Nicolet公司；F-7000熒光光譜儀，日本國立公司；高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 亞麻籽蛋白的提取

亞麻籽蛋白(flaxseed protein isolate，FPI)的提取方法主要參考YANG等[9]的方法：取100 g亞麻籽餅粉，比例1∶5(g∶mL)的比例加入石油醚，除去殘留的亞麻籽油。將除油后的亞麻籽餅粉按比例1∶20(g∶mL)的比例加入去離子水，調整溶液pH值為9.5，攪拌2 h。然后將溶液在4 ℃，4 000×g的條件下離心20 min，重復上述步驟3次后合并上清液。調整上清液的pH值為4.0，離心收集沉淀，將沉淀溶于水并調整其pH值為7.0。最后將復溶后的溶液冷凍干燥得到亞麻籽蛋白粉末，并用凱氏定氮法測其蛋白含量。

1.2.2 納米復合物的制備

取一定量的亞麻籽蛋白粉末溶于去離子水，配成20 mg/mL的原始蛋白溶液。將5 mg/mL的紫檀芪乙醇溶液按照體積比1∶10逐滴加入亞麻籽蛋白溶液中，避光攪拌3 h。最后將其離心除去游離的紫檀芪得到亞麻籽蛋白-紫檀芪復合物溶液(flaxseed protein isolate-pterostilbene nanocomplex，FPN)。

將新鮮制備的FPN復合物溶液與10 mg/mL的SSPS溶液等體積混合，用1 mol/L HCl調整溶液pH值為2.0～5.0，得到亞麻籽蛋白-紫檀芪-大豆多糖復合物溶液(flaxseed protein isolate-pterostilbene-soluble soybean polysaccharide nanocomplex，FPSN)，研究pH對復合物的影響。將新鮮制備的FPN復合物溶液與不同質量濃度(5～25 mg/mL)的SSPS溶液等體積混合，用1 mol/L HCl調整溶液pH值為3.5，得到FPSN，研究SSPS濃度對復合物的影響[8]。

1.2.3 納米復合物的表征

將新鮮制備的復合物溶液用去離子水稀釋到0.1% 以避免多重散射，利用馬爾文激光粒度儀測定樣品的平均粒徑、電位和多分散性指數(polydispersion index，PDI)。測試條件設置為：固定角度173°，蛋白顆粒折射率1.763，氦氖激光器為633 nm[10]。

1.2.4 包埋率的測定

根據LIU等[11]的方法測定復合物中結合的紫檀芪含量。取1 mL樣品加入乙酸乙酯，漩渦振蕩2 min，靜置分層后收集上層液體，重復萃取3次后合并有機相。樣品經過0.22 μm微孔濾膜過濾后，用Waters高效液相色譜(UV檢測器)測定樣品中紫檀芪的含量。色譜柱為C18柱，檢測波長為305 nm，流動相為55%(體積分數)乙腈，流速為1 mL/min，柱溫為30 ℃，進樣量為20 μL。根據標準曲線計算紫檀芪含量(Y=168.55X-11.795,R2=0.998 8)。包埋率按公式(1)計算：

(1)

1.2.5 熒光光譜分析

將樣品適當稀釋，加入不同濃度梯度的紫檀芪乙醇溶液(0～50 μg/mL)，用F-7000型熒光光譜儀(日本日立公司)測定樣品的熒光光譜。固定激發波長280 nm，光譜測定范圍300～450 nm，掃描速度為1 200 nm/min，狹縫寬度5 nm[4]。

1.2.6 傅里葉紅外光譜分析

將10 mg冷凍干燥后的樣品與1.0 g的溴化鉀混合均勻后壓片，以溴化鉀為空白背景進行掃描。波長范圍400～4 000 cm-1，分辨率4 cm-1，掃描次數32次，最后結果用Peakfit 4.12 軟件進行分析處理[12]。

1.2.7 納米復合物的穩定性分析

調節復合物溶液pH值為2.0～8.0，以粒徑和電位分析樣品在不同pH條件下的穩定性。類似地，在紫檀芪納米復合物溶液中加入NaCl，使其鹽離子濃度為0～500 mmol/L，通過電位來分析樣品在不同鹽離子條件下的穩定性。

1.2.8 數據分析

所有實驗進行3次。采用SPSS軟件進行方差分析，并用Duncan多重比較進行顯著性分析(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 納米復合物制備參數的研究

2.1.1 pH對復合物包埋效果的影響

亞麻籽蛋白的等電點為4～5[13]，pH<4時，亞麻籽蛋白帶正電，大豆多糖帶負電，二者可以通過靜電相互作用形成核殼結構的納米顆粒[8]。如圖1所示，pH=2時，納米顆粒的包埋率最小，僅為70.12%，其Zeta 電位大約為-19.3 mV，此時顆粒間的靜電排斥作用弱，容易聚集沉淀，導致離心后上清液中的紫檀芪含量變少，因而其包埋率最小。pH=3.5時，包埋率達到95.06%，在該條件下，亞麻籽蛋白與大豆多糖帶相反電荷，有助于二者之間的相互作用，此時整個體系分散均勻，因此選擇pH=3.5來制備納米復合物。

A-粒徑與PDI；B-包埋率圖1 pH對FPSN粒徑、PDI和包埋率的影響Fig.1 Effect of pH on the particle diameter, PDI and encapsulation efficiency of FPSN

2.1.2 多糖質量濃度對復合物包埋效果的影響

如圖2所示，未添加大豆多糖時，復合物帶正電荷。隨著大豆多糖的加入，復合物表面吸附的大豆多糖逐漸增加，納米顆粒平均粒徑逐漸增大，復合物表面的凈電荷增加，使得顆粒之間的靜電斥力變大。質量濃度達到10 mg/mL后，電位趨于穩定，且其電位值與大豆多糖在pH=3.5時的電位值相似，表明大豆多糖纏繞在了亞麻籽蛋白的表面，其靜電斥力阻止了顆粒間的聚集。大豆多糖質量濃度過高會使顆粒粒徑變大，體系分散不均勻，因此選擇10 mg/mL作為最佳濃度，此時復合物表面的大豆多糖也達到飽和，分散液也比較穩定。

A-粒徑和PDI；B-Zeta電位圖2 大豆多糖質量濃度對FPSN電位、粒徑和PDI的影響Fig.2 Effect of SSPS concentration on the zeta potential, particle diameter and PDI of FPSN

2.2 顆粒間的相互作用分析

2.2.1 熒光光譜分析

蛋白質分子中的酪氨酸、色氨酸等氨基酸殘基具有熒光，可在280 nm波長處被激發，而且這些氨基酸殘基對微環境的變化很敏感，因此可以利用熒光光譜法來研究疏水性生物活性分子與蛋白質之間的相互作用[14]。如圖3所示，在280 nm的激發波長下，亞麻籽蛋白在350 nm處出現了峰值。隨著紫檀芪濃度的增加，亞麻籽蛋白的熒光強度逐漸變小，說明紫檀芪的加入使得亞麻籽蛋白發生了熒光猝滅。還可以看到亞麻籽蛋白的最大熒光發射波長發生了紅移現象(350～357 nm)，表明色氨酸進入了一個更加親水的微環境，同時也可以得出紫檀芪與亞麻籽蛋白之間存在疏水相互作用的結論。CHEN等[15]通過將大豆蛋白與百里酚結合來改善百里酚的穩定性，百里酚對大豆蛋白有熒光猝滅效應，二者之間存在疏水相互作用。

圖3 紫檀芪對亞麻籽蛋白內源熒光猝滅情況Fig.3 Typical profiles for the quenching of intrinsic fluorescence of FPI, by increasing concentrations of PTS

2.2.2 傅里葉紅外光譜分析

A-PTS；B-SSPS、FPI、FPN、FPSN圖4 PTS、FPI、SSPS、FPN、FPSN的紅外光光譜圖Fig.4 FTIR spectra of PTS, FPI, SSPS, FPN and FPSN

2.3 穩定性分析

2.3.1 pH穩定性

Zeta電位是表征膠體穩定性的重要指標之一。其絕對值越大，表明顆粒間的斥力越大，整個體系越穩定。相反，其絕對值越小，體系越不穩定，容易聚集沉淀[18]。納米顆粒表面的Zeta電位隨pH的變化如圖5所示，由于大豆多糖的存在，FPSN的帶電量高于FPN。在中性條件下，由FPN和FPSN均帶負電，隨著pH的降低，復合物的|Zeta|逐漸變小。FPN在pH=4～5時凈電荷為0，隨著pH的進一步降低，Zeta 電位變為正，且其值逐漸變大。

由圖5可知， pH=4、5時，FPN的平均粒徑明顯高于其他pH條件下的粒徑。這是因為在等電點附近，FPI所帶凈電荷幾乎為0，顆粒間的斥力較小，體系不穩定，導致其粒徑比較大。pH=2時，FPSN復合物體系穩定性較差，相互作用較弱，容易聚集。隨著pH的增大，FPSN的平均粒徑保持在250 nm左右，其溶解度提高，沒有沉淀產生，說明大豆多糖的加入有效提高了復合物的穩定性。大豆多糖之所以能夠改善蛋白在酸性條件下的穩定性，是因為大豆多糖有復雜的多糖鏈，可以纏繞在蛋白表面，通過空間位阻效應以及靜電排斥力阻止蛋白的聚集。

A-Zeta電位；B-平均粒徑圖5 pH對FPN和FPSN納米復合物的影響Fig.5 Effect of pH value on FPN and FPSN nanocomplex

2.3.2 鹽離子穩定性

蛋白基納米顆粒對鹽離子的穩定性較差，因此有必要研究鹽離子對所制備復合物穩定性的影響。由圖6可知，2種復合物電位隨著鹽離子濃度的變化趨勢是相似的，隨著鹽濃度的增大，顆粒表面的凈電荷減少，其電位值變小，原因可能是鹽離子屏蔽了蛋白表面的電荷，從而削弱了亞麻籽蛋白與大豆多糖之間的相互作用，導致顆粒的聚集。盡管鹽離子降低了FPSN的表面電荷，但其帶電量仍然高于FPN。FPSN表面的大豆多糖為納米粒子提供了空間位阻，可以使納米粒子在高離子強度下保持穩定[19]。LI等[20]制備了大豆蛋白-二十八烷醇納米復合物，發現該復合物的 Zeta電位也隨著鹽離子濃度的增加而降低。

A-FPN；B-FPSN圖6 鹽離子濃度對FPN和FPSN納米復合物Zeta電位的影響Fig.6 Effect of ion concentration on zeta potential of FPN and FPSN nanocomplex

3 結論

本研究制備了亞麻籽蛋白-紫檀芪-大豆多糖納米復合物來改善紫檀芪的水溶性及穩定性。溶液pH值為3.5且大豆多糖質量濃度為10 mg/mL時，包埋率達到95.06%，此時整個體系分散比較均勻。通過熒光光譜和傅里葉紅外光譜發現，亞麻籽蛋白、大豆多糖、紫檀芪在形成復合物時存在相互作用，主要為疏水相互作用、靜電相互作用和氫鍵作用力。加入大豆多糖后，納米復合物在酸性條件和高鹽條件下的穩定性得到明顯改善。本研究制備的亞麻籽蛋白-紫檀芪-大豆多糖納米復合物具有應用于醫藥、功能性食品的潛力。