產阿魏酸酯酶菌株的篩選與產酶條件優化

段曉莉，江波，張濤

(江南大學,食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

阿魏酸(ferulic acid，FA)廣泛存在于植物細胞壁，與多糖、木質素間以醚鍵或酯鍵形成網狀結構[1]，以增強細胞機械強度與完整性，同時降低生物分解率[2]。FA是公認安全的抗氧化劑，在歐洲國家已被列入食品添加劑。此外，研究表明，FA具有紫外吸收、抗菌消炎、防癌降脂等生物活性，在醫藥、化妝、造紙等領域有廣泛應用前景[3]。目前，生產阿魏酸方法有植物提取法、化學合成法和生物酶法。植物提取法通過酸堿水解的方式破壞植物內其他高價值化學成分，同時副產物增多，產物分離困難，因此能耗大，污染環境。化學合成法通過有機反應合成FA，但反應時間長，環境污染嚴重。相比而言，生物酶法則具有反應條件溫和，專一性高，產物得率高，對環境友好等優點[4]，這些優點使生物酶法成為生產FA的研究熱點。

阿魏酸酯酶(feruloyl esterase，FAE，E.C.3.1.1.73)，屬于羧酸酯酶亞類，可催化水解阿魏酸與多糖、纖維素、木質素間的酯鍵或醚鍵，生成阿魏酸[5]。此外，在三元有機溶劑體系中，阿魏酸酯酶還可通過酯交換反應生產阿魏酰寡糖或羥基肉桂酸酯等衍生物[6]。FAE廣泛分布于植物和微生物中，目前產FAE微生物主要有曲霉屬[7]、青霉屬[8]等絲狀真菌，放線菌[9]、乳酸菌[10]、芽孢桿菌[11]等細菌。不同來源FAE其酶學性質、序列同源性、空間結構有較大差異，目前對黑曲霉來源的FAE研究較深入。盡管真菌產阿魏酸酯酶能力強，但真菌來源的FAE分離困難，發酵酶活力低，耐熱性差等缺點導致其難以規模化生產[12]，因此發掘更多細菌來源、酶活力高的阿魏酸酯酶成為亟需解決的問題并獲得國內外學者廣泛關注。

本研究從土壤中分離鑒定得到1株產阿魏酸酯酶的菌株SK52.001；確定了最佳碳源及濃度，最佳氮源和培養基初始pH值；明確FAE是誘導性酶，為更多細菌來源的阿魏酸酯酶提供了理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 材料

土壤：在江蘇無錫貢湖灣濕地和長廣溪濕地隨機挑選10個地點采集土壤下5～10 cm深腐殖質土壤。

小麥麩皮：江蘇無錫歐尚超市。

1.1.2 儀器與設備

Agilent 1200型高效液相色譜儀，美國Agilent公司；Waters ACQUITY UPLC液相色譜串聯四極桿飛行時間質譜儀，美國沃特世公司。

1.1.3 培養基

分離培養基(g/L)：馬鈴薯200，蔗糖20，瓊脂15～20；pH值自然，121 ℃滅菌20 min。

種子培養基(g/L)：馬鈴薯200，蔗糖20；pH值自然，121 ℃滅菌20 min。

篩選固體培養基(g/L)：NaNO32，K2HPO4·3H2O 1，KCl 0.5，MgSO4·7H2O 0.5，FeSO4·7H2O 0.01，瓊脂15～20；pH值自然，115 ℃滅菌30 min。0.22 μm濾膜過濾100 mg/L阿魏酸乙酯的N,N-二甲基甲酰胺溶液，添加10%(體積分數)阿魏酸乙酯溶液至滅菌培養基中，搖勻至培養基呈均勻的乳白色溶液后倒平板。

基礎發酵產酶培養基[13](g/L)：麥麩20，NaNO32，K2HPO4·3H2O 1，KCl 0.5，MgSO4·7H2O 0.5，FeSO4·7H2O 0.01；pH值自然，115 ℃滅菌30 min。

LB培養基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10；pH值自然，121 ℃滅菌20 min。

1.2 菌株篩選

1.2.1 菌株分離

稱取土樣1.0 g加入到10 mL含玻璃珠的無菌水，于30 ℃，200 r/min振蕩30 min，靜置2 min后取上清液梯度稀釋，并將稀釋懸浮液取100 μL涂布于分離培養基，倒置于30 ℃培養箱培養至單菌落長出。

1.2.2 菌株篩選

將分離培養基的單菌落挑至篩選培養基，利用以阿魏酸乙酯為唯一碳源的篩選平板篩選。于30 ℃ 培養箱倒置24 h，觀察菌落周圍是否有透明圈出現。若有透明圈，則說明該菌株具有阿魏酸酯酶活性。

將有阿魏酸酯酶活性的菌落劃線純化，將純培養物接種至種子培養基，30 ℃，200 r/min培養18 h，按5%接種量接種至基礎發酵產酶培養基培養7 d，定時取發酵液檢測其是否存在阿魏酸酯酶活性。

1.3 阿魏酸酯酶活力測定

1.3.1 測定方法

粗酶液制備：1 mL發酵液室溫下以10 000 r/min離心10 min，發酵上清液即為粗酶液。

酶反應：1 mL酶反應體系中含250 μL粗酶液和750 μL濃度為0.003 mol/L 阿魏酸甲酯(溶解在0.050 mol/L Tris-HCl緩沖溶液，pH值8.0)。酶反應體系在50 ℃水浴鍋反應15 min后立即煮沸滅酶10 min ，終止酶反應，12 000 r/min離心2 min，取上清液制樣。以加入等量蒸餾水代替粗酶液為空白對照，其他操作相同。

酶活力單位定義：一定溫度下，1 min水解阿魏酸甲酯生成1 μmol阿魏酸所需要的酶量為1個酶活力單位(1 U)。

1.3.2 高效液相色譜檢測條件

色譜條件參照文獻[14]的方法，并加以改進。Agilent 1200型高效液相色譜儀；色譜柱為ZORBAX Eclipse Plus C18(Agilent，4.6 mm×150 mm，3.5 μm)；紫外檢測器；流動相A：1%乙酸溶液，流動相B：甲醇；流速1 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長320 nm，梯度洗脫程序如表1所示。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

1.4 酶反應產物LC-MS鑒定

色譜條件：Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×150 mm，1.7 μm)；Waters ACQUITY PDA檢測器；流動相A：0.1% 甲酸，流動相B：乙腈；梯度洗脫分離條件：0～40 min，100%～70% A；40～45 min，70%～20% A；45～50 min，20%～0% A；50～55 min，0%～100% A；流速0.3 mL/min；柱溫45 ℃。

質譜條件：錐孔電壓30 V；毛細管電壓3.5 V；ESI陰離子電離噴霧源；脫溶劑汽溫度400 ℃；脫溶劑汽流量700 L/h；離子源溫度100 ℃；錐孔汽流量50 L/h；質量掃描范圍20～2 000m/z。

1.5 目標菌株鑒定

1.5.1 菌株形態鑒定

目標菌株純培養物劃線于LB平板，觀察菌落形態和顏色；并進行革蘭氏染色及菌株個體形態觀察。1.5.2 生理生化特征

參照《伯杰氏系統細菌學手冊》[15]及《常見細菌系統鑒定手冊》[16]進行目標菌株生理生化特征檢測。

1.5.3 分子生物學鑒定

菌株16S rRNA 基因測序由天一輝遠生物科技有限公司完成。將16S rRNA序列在NCBI(National center for Biotechnology Information)數據庫進行比對分析，并采用MEGA 7.0軟件繪制系統發育樹。

1.6 發酵產酶條件優化

發酵條件采用以下方式：挑取單菌落至50 mL LB培養基于30 ℃，200 r/min 培養18 h后，按5%接種量接種至發酵產酶培養基，30 ℃，200 r/min培養26 h，250 mL錐形瓶裝液量為25 mL，測定發酵結束的菌體生長量及發酵上清液酶活力，每次優化的結果均用于之后的實驗中。

1.6.1 碳源種類及濃度

去淀粉小麥麩皮[17]：麩皮浸沒于質量分數為0.3%的醋酸鉀溶液中，95 ℃水浴1 h，其間不斷攪拌，去離子水反復沖洗至淀粉完全去除，105 ℃烘干至恒重。

以10 g/L葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、D-木糖、木聚糖、可溶性淀粉、小麥麩皮(wheat bran，WB)、去淀粉小麥麩皮(destarched wheat bran，DSWB)作為唯一碳源確定最佳碳源。改變最佳碳源濃度，分別為5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 g/L，確定最佳碳源濃度。

1.6.2 復合碳源

額外添加5 g/L葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、D-木糖和木聚糖為復合碳源，以45 g/L WB為對照[18]。

1.6.3 氮源種類

以5 g/L胰蛋白胨、大豆蛋白胨、魚粉蛋白胨、酵母提取物、硫酸銨、尿素、硝酸鈉為唯一氮源，以不加入氮源為對照。

1.6.4 初始pH值

分別調節發酵產酶培養基初始pH值為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，確定菌株生長的最適初始pH值。

1.7 發酵產酶曲線測定

將種子液分別接種至誘導性碳源(45 g/L麩皮)，非誘導性碳源(45 g/L葡萄糖)，以非誘導性碳(45 g/L葡萄糖)預培養至對數中期后添加45 g/L麩皮的發酵產酶培養基中，于30 ℃，200 r/min搖床培養，每隔一定時間取樣測定OD600值和發酵酶活力。

2 結果與分析

2.1 菌株篩選結果

土樣經分離和篩選后，共獲得105株菌，其中8株產阿魏酸酯酶，發酵酶活力見表2。3號菌株的阿魏酸酯酶活力最高，達195 U/L，因此命名3號菌株為SK52.001，作為后續研究菌株。

表2 菌株產酶活力測定 單位：U/L

2.2 酶反應產物LC-MS結果

由圖1-a全離子色譜圖可知，目標產物阿魏酸在3.64 min出單峰。在負離子模式一級質譜圖中，相同保留時間的是[M-H]-分子離子峰，因此由質譜圖1-b中相對豐度最高的碎片m/z=193可知，目標產物的相對分子質量為194，與阿魏酸單體的相對分子質量一致。

a-色譜圖；b-質譜圖圖1 酶反應產物LC-MS圖譜Fig.1 Result of SK52.001 product by LC-MS

2.3 菌種鑒定

2.3.1 形態學鑒定

該菌株在LB固體平板上的菌落為圓形，較薄，中間呈淺黃色，邊緣微白，表面黏稠濕潤，邊緣凹凸不整齊(圖2)。細胞呈短桿狀，兩端鈍圓，具有典型的芽孢桿菌的形態特征，屬于革蘭氏陽性菌。

2.3.2 生理生化特征

菌株SK52.001生理生化鑒定結果如表3所示。

2.3.3 分子生物學鑒定

測序結果顯示，SK52.001的16S rRNA基因序列含1 404個堿基，經NCBI在線數據庫比對后發現，其與多種芽孢桿菌屬菌株同源性達100%，結合該菌株生理生化試驗與形態學特征，最終確定SK52.001為短小芽孢桿菌。為進一步確定目標菌株與已知芽孢桿菌屬菌株間親緣關系，采用MEGA 7軟件構建系統進化樹，采用Neighbor-Joining分析法[19]，通過1 000次步長檢驗得到系統發育樹，如圖3所示。

圖3 利用Neighbor-Joining法構建菌株SK52.001的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain SK52.001 constructed by method of Neighbor-Joining 注：★為本研究菌株

2.4 發酵培養基優化

2.4.1 碳源種類與濃度

當發酵產酶培養基中碳源種類不同時，菌體生長量及阿魏酸酯酶活力存在顯著差異，見圖4-a。以葡萄糖等簡單糖為碳源時，FAE發酵酶活力低，這與SHIN等[20]研究結果基本一致。以麩皮和DSWB為碳源時，菌體生長量較高，一方面可能是麩皮中含多種蛋白質及營養物質如尼克酸、硫胺酸等，可以滿足菌體生長需求[21]，另一方面FAE為誘導酶[22]，麩皮與DSWB含有阿魏酸酯鍵可誘導生產大量FAE提高酶活力。其中，以麩皮為碳源時FAE酶活力最高，可能是由于DSWB中水溶性物質營養成分流失。

以麩皮為碳源時，探究了不同濃度對FAE酶活力的影響(圖4-b)。當麩皮質量濃度低于45 g/L時，FAE酶活力隨著麩皮濃度的增加而提高，當麩皮質量濃度在45 g/L時，FAE酶活力最高，隨后酶活力呈現下降趨勢。可能是因為過高的麩皮濃度使培養基中水分含量和空氣通量減少[23]，菌體的FAE合成能力下降；同時，麩皮不斷被分解利用使培養基中球形顆粒增多，濁度增加，因此在600 nm處的光密度增加。

2.4.2 復合碳源

本實驗還探究了當麩皮質量濃度為45 g/L時，添加其他糖共發酵對酶活力影響(圖4-c)。研究表明，簡單糖的存在一定程度上抑制FAE的生產，這與之前研究相同[18]，該現象可能是菌體生長產酶過程中，簡單糖與麩皮作為碳源相互競爭，過多碳源抑制微生物生長，進而減少FAE表達分泌。因此，選擇質量濃度為45 g/L麩皮為唯一碳源時，FAE酶活力最高。

2.4.3 氮源種類

氮源是菌體生長和細胞代謝的重要營養物質，SK52.001利用不同氮源生長產酶情況不同(圖4-d)。麩皮作為天然化合物包括淀粉、蛋白質、纖維素等營養物質，也可作為氮源，因此選用不額外添加氮源的培養基作為對照組。結果顯示，有機氮源酶活力普遍高于無機氮源，可能是由于有機氮源中的小分子肽更易于菌體吸收利用，而無機氮源轉化率低，降低菌體生長代謝速率，造成產酶量減少[24]。麩皮作為氮源，其結構復雜，氮源提供不足，菌體利用率低使生長受抑制，產酶量少。當發酵培養基含5 g/L胰蛋白胨時，FAE酶活力最高，大豆蛋白胨次之。然而，與早期報道[25]結果不同，有機氮源如酵母提取物蛋白胨不支持阿魏酸酯酶的生產，主要是由于產酶菌株對氮源的利用率不同。

a-碳源種類；b-麩皮濃度；c-復合碳源；d-氮源種類圖4 產酶培養基成分優化Fig.4 Optimization in the medium for the FAE production

2.4.4 初始 pH值

培養基pH值直接影響菌體代謝及產酶，過酸過堿的生長環境都抑制菌體生長代謝。由圖5可知，在pH值為6.0時FAE酶活力達421 U/L。曹艷等[26]研究顯示，溜曲霉FD-8(Aspergillustamarii，FD-8)發酵產酶培養基最適pH值為6.0，在該pH值下，菌體生長量最多，可合成更多的FAE，進而提高FAE酶活力。

圖5 初始pH值優化Fig.5 Optimization of initial pH values

2.5 發酵產酶曲線

分別考察以葡萄糖為碳源，以麩皮為碳源，以葡萄糖為碳源培養至對數中期加麩皮誘導產酶在不同發酵時間的OD600和發酵酶活力(如圖6所示)。當以葡萄糖為碳源時，菌株生長16 h進入穩定期，而FAE酶活力極低，且幾乎無變化，說明葡萄糖僅供菌株維持基本生長代謝。當以麩皮為碳源時，菌株培養24 h進入穩定期，隨后隨OD600緩慢增加酶活力也不斷升高，培養至32 h時FEA酶活力最高。當以葡萄糖為碳源預培養8 h后添加麩皮誘導產酶44 h時，FAE酶活力顯著提高至808 U/L，說明麩皮的添加可誘導菌株生產FAE，前期葡萄糖提供菌株生長所需碳源，之后補加麩皮，一方面提供產酶誘導物，另一方面進一步補充供微生物生長的營養物質，所以菌體量與產酶量均高于僅用麩皮或葡萄糖為碳源的產量。以上結果表明，該菌株所產FAE是誘導型表達，只有當培養基中存在誘導物時，FAE才能大量表達。

近年來國內外報道生產阿魏酸酯酶的不同菌株發酵產酶條件和酶活力見表4。本研究中短小芽孢桿菌來源的阿魏酸酯酶在國內外報道較少，且發酵酶活力可達808 U/L，在工業中有巨大的潛在應用價值。

表4 阿魏酸酯酶發酵酶活力Table 4 Enzyme activity of FAE

3 結論

本實驗從江蘇無錫貢湖灣濕地和長廣溪濕地土壤中分離出1株產阿魏酸酯酶的菌株，通過對此菌株進行形態學特征觀察、生理生化試驗及分子生物學鑒定，構建系統發育樹后確定該菌株為短小芽孢桿菌BacilluspumilusSK52.001。其酶反應產物經過LC-MS后可確定該酶為阿魏酸酯酶，利用該菌株在30 ℃，200 r/min條件下，當接種量為5%時，在45 g/L麩皮，5 g/L胰蛋白胨，培養基初始pH值為6.0時，發酵培養26 h，發酵液中的阿魏酸酯酶活力達到421 U/L，比原始酶活力(195 U/L)提高115%。當菌株在以45 g/L葡萄糖為碳源的發酵產酶培養基中預培養8 h，加入45 g/L麩皮誘導產酶44 h時，發酵液中阿魏酸酯酶活力最高，達到808 U/L。研究結果表明，篩選得到的菌株B.pumilusSK52.001是一種具有工業化生產能力的阿魏酸酯酶生產菌。