轉谷氨酰胺酶對食品蛋白特性的影響

馮倩，曲映紅，施文正

(上海海洋大學 食品學院，國家淡水水產品加工技術研發分中心(上海)，上海，201306)

天然蛋白存在著溶解度低、凝膠性差、起泡性弱、易致敏等缺點，采用酶法技術改變蛋白結構，改善其特性，以提高食品品質，擴大銷售范圍。酶法改性是利用酶催化蛋白水解或蛋白交聯，從而使得蛋白分子發生水解或蛋白分子間(內)發生交聯，來達到改變蛋白的功能特性的目的。目前，催化蛋白交聯的酶主要有以下4類：轉谷氨酰胺酶(transglutaminase，TGase)、酚氧化酶、過氧化物酶、賴氨酰氧化酶。其中，TGase研究的較為深入。如表1所示，該酶催化底物廣泛，性能改善明顯。

表1 轉谷氨酰胺酶對食品性能的影響Table 1 Effect of transglutaminase on food properties

TGase根據來源不同可以將轉谷氨酰胺酶分為內源性轉谷氨酰胺酶及微生物來源轉谷氨酰胺酶(microbial transglutaminase，MTGase)。內源性轉谷氨酰胺酶在自然界中存在廣泛，但從植物或動物中提取得到的該酶產量低、提純難且催化反應依賴Ca2+。相比于MTGase，內源性轉谷氨酰胺酶催化活性位點被Cys殘基和Try殘基組成的氫鍵覆蓋，只有當底物中存在Ca2+，才能發生構象變化，暴露出活性位點；而MTGase催化活性位點上的Cys64能夠充分暴露在溶劑中，因此反應不需要依賴Ca2+且反應迅速[1]。TGase在參與催化反應時，酰基供體為該酶肽鏈上谷氨酰殘基的γ-酰基，酰基受體可以為賴氨酸上的ε-氨基、伯氨基和水。根據受體的不同，反應可分為蛋白質交聯反應，酰基轉移反應和脫酰胺基反應。各反應對蛋白特性的影響如圖1所示。本文將從蛋白功能特性、其他特性及與新技術復合使用3個方面進行闡述。

圖1 TGase催化食品蛋白改性反應及機制Fig.1 Modification reactions and mechanisms of food protein catalyzed by TGase

1 轉谷氨酰胺酶對食品蛋白功能特性的影響

1.1 凝膠性

凝膠是介于固體和液體之間的中間狀態，通過共價或非共價鍵交聯聚合物分子，形成能夠截留水或其他小分子物質的三維網絡結構，是食品蛋白重要功能特性之一。與傳統的熱致凝膠相比，TGase可催化低濃度蛋白，甚至不能成膠的蛋白溶液形成凝膠，且凝膠的凝膠強度和彈性模量遠遠大于相同條件下的熱致凝膠。蛋白的凝膠作用可以形成獨特物理狀態的食物，如豆腐、酸乳、干酪等。

在豆制品中，酶較易催化7S球蛋白聚合，不易使11S球蛋白聚合；且只能使蛋白中的酸性亞基聚合，幾乎不能使其堿性亞基聚合[10]。這主要是因為7S球蛋白含有相對較高含量的谷氨酰胺和賴氨酸，而谷氨酰胺和賴氨酸是TGase的主要底物。TGase交聯大豆分離蛋白有助于豆腐形成更持久的凝膠，并能更長久地保存豆腐的結構特性[11]。

在肉制品加工過程中，TGase通過交聯作用，改變肌球蛋白重鏈結構，降低α-螺旋含量，增加β-折疊含量，有助于形成高分子聚合物，改善蛋白溶解度，從而改變蛋白凝膠性。在交聯時，TGase的首要目標是肌球蛋白中的S1亞基。由于空間受限，肌球蛋白易被氧化。在輕度氧化條件下，TGase誘導的肌球蛋白交聯區域在肌原纖維結構中由S1亞基向S2亞基轉移[12]。TGase可以在輕度氧化時促進S2交聯，S2可成為新的交聯區域，該發現可應用于不需被抑制氧化的肉制品加工中。在所有肉制品加工過程中，TGase只會對肌球蛋白產生作用，對肌動蛋白沒有明顯影響[13]。

在乳制品中，TGase的主要作用蛋白還存有異議。有學者認為TGase對乳清蛋白的作用不明顯，主要作用于κ-酪蛋白[14]，因為其主要位于酪蛋白膠束的表面，接近酶催化位點。酪蛋白交聯后，可防止尿素及檸檬酸的分離，對酸乳發酵等有一定的指導意義。在乳制品的加工中，凝乳酶的類型、TGase的添加順序，酶的孵育時間都會影響乳制品的品質、出成率[15-16]。TGase在凝乳酶之前加入，會引起其與凝乳酶活性的競爭反應，從而使得產品品質下降[17]。但也有學者[18]研究發現在加入凝乳酶之前加入TGase，生產的奶酪，產量更高、質地更軟。二者的矛盾可能是由凝乳酶的類型不同造成的。目前，研究乳制品多集中在中性條件，但是在酸性條件下的交聯還未被深入探究。

1.2 持水力

持水力通常定義為蛋白截留水及儲存水的能力，即蛋白與水的相互作用。水分是大多數食品中含量最高的組分，含量及分布狀態通常影響著產品的嫩度、鮮度、貨架期及風味等。SEIGHALANI等[19]研究了不同TGase水平對紅羅非魚魚糜凝膠特性的影響，其結果表明TGase(0.30 U/g魚糜)的交聯作用提高魚糜凝膠持水力，主要是因為形成的蛋白凝膠，網絡結構致密均勻，從而截留住更多的水。TGase催化的脫酰胺反應，降低面包烘焙損失，蛋白質的親水性增加，使得其與蛋白質重鏈聚合產生的強凝膠結構結合[20]。但是在玉米研究中發現，酶的脫酰胺作用普遍存在，底物中蛋白質和賴氨酸含量有限，阻礙了交聯的形成，使得玉米面包的黏度降低。

因此，MTGase催化的脫胺反應和交聯的形成直接影響不同蛋白質底物的持水力。與凝膠性相似，隨著酶添加量的持續增加，酶添加量與持水力呈負相關。因為蛋白間和蛋白內的交聯數越多，蛋白與水的相互作用越低，蛋白截留水越困難。

1.3 乳化特性

蛋白質的乳化特性影響著冰淇淋、蛋糕等食品的品質。在乳液體系中，蛋白質作為主要的表面活性劑，其較好的表面活性有助于分散相的形成和穩定。良好的表面活性劑必須具有以下特點：(1)快速進行界面吸附；(2)在界面上快速分散及重新定位；(3)在到達界面時，能與鄰近分子相互作用，形成能夠承受熱沖擊和機械沖擊的、強而有黏性的黏彈性膜[21]。

TGase的交聯和脫酰胺反應都影響著蛋白的乳化特性。交聯反應使豬肉肌原纖維蛋白結構發生改變，促進分子聚集到油滴表面，產生靜電排斥，從而阻止聚集、絮凝和油水兩相分離，提高乳液的穩定性[22]；在研究肌原纖維蛋白-非肉蛋白-橄欖油復合乳化液時，異型肽鍵的生成改變了蛋白表面基團的疏水基團/親水基團的比率，可能改變蛋白構象，增加負電荷的數量，有助于在乳液界面形成更有彈性的蛋白膜，從而增加蛋白乳化穩定性[23]；但有學者研究鯉魚肌原纖維蛋白時發現，乳化性降低，交聯反應破壞了蛋白與蛋白之間的熱力學平衡，溶解性降低，平均粒徑增加，乳化粒子減少[24]。綜上，乳化特性的改變可能與交聯度相關。此外，脫酰胺反應會導致pH下降，極性基團增加，進而促進蛋白質在水面上的展開[25]。范麗麗等[26]發現，在酶添加量為20 U/g，pH 7.0，溫度55 ℃條件下，表面疏水性增強，提升了蛋白對油脂的吸附，改善了蛋白的乳化性。

2 轉谷氨酰胺酶對食品蛋白其他特性的影響

2.1 致敏性

食物過敏是因為食物變應原進入身體后，自身免疫系統受到不良反應所產生的現象。目前，沒有有效的方法來預防或根除食物過敏，過敏藥物也只能通過緩解癥狀來減少不良反應的產生。食物中大多數過敏原為鹽溶性蛋白，具有耐酸、耐蛋白酶酶解特性。利用TGase交聯蛋白，產生大分子聚合物，改變蛋白表位，將暴露在表面的抗原表位包埋在蛋白分子內部，降低過敏反應。但交聯過度會發生反作用，使蛋白過度聚集，形成較大的蛋白顆粒，從而產生致敏性[27]。MENG等[3]發現酶解后，花生水解物的免疫球蛋白E(immunoglobulin，IgE)結合能力下降，相比于酶水解，TGase交聯對其致敏性無明顯影響；但XING等[28]研究了TGase交聯對乳酸菌介導牛奶-豆奶混合物致敏性的影響，發現酶交聯可有效降低該生物豆腐的致敏性。FOTSCHKI等[29]研究TGase交聯后的牛奶和馬奶之間的致敏性差異時發現，改性后馬奶的致敏性較低；其結果的差異主要是因為牛奶中存在TGase抑制劑，且馬奶中致敏酪蛋白的含量低，僅為牛奶的1/4。綜上致敏性的改變可能與交聯度、底物的種類相關。當與酪氨酸酶聯合使用時，也可顯著降低蝦原肌球蛋白的變應原性[30]。TGase與催化交聯酶聯合使用，可能有一定的協同作用，但兩者之間的協同機理、交聯位點的變化還需進一步探究。

2.2 消化性

TGase改性使蛋白產生不同數量的異型肽鍵，改變了肌球蛋白重鏈聚集度和凝膠網絡結構的交聯度，導致蛋白分子結構和蛋白-蛋白結合距離發生變化，形成穩定的、不同孔徑的蛋白網絡結構[31-32]。蛋白聚集體分子質量增加，會影響胃消化過程和營養物質傳遞，使機體保持一定的飽腹感，從而能夠達到控制能量攝入的目的；這對研發低血糖生成指數(glycemic index，GI)食物具有一定的啟示作用。FANG等[33]在探究TGase改性鰱魚魚糜消化過程中的營養物質氨基酸及肽的釋放時發現，在消化30 min后，TGase交聯的魚糜凝膠消化率相比于未交聯的更高，且增加了氨基酸及肽的釋放量，即改性后的魚糜凝膠營養價值較高。未來可進一步進行動態體外胃腸模型胃、腸消化實驗和體內研究，探究TGase改性蛋白的消化機制和吸收特性。

人體TGase催化的脫酰胺反應中，谷蛋白去酰胺化會激活乳糜瀉發病機制，這使得在小麥制品中添加TGase引起了爭議。OGILVIE等[34]研究發現，在面包中添加TGase(0～2 000 U/kg)不會產生活性谷蛋白肽，即添加TGase不會造成風險。改性后的蛋白消化后，能釋放多種生物活性肽，且多數具有抗氧化性、抗炎性，提高營養價值[35-36]。

2.3 風味

目前TGase改性多集中在對蛋白功能特性改變的研究上，對于風味的吸附及釋放研究較少。揮發性成分的傳質阻力的改變可以改變風味在蛋白凝膠中的整體平衡。風味與蛋白結合作用中，表征為疏水的可逆結合可以降低加工過程中的風味損失；TGase催化的異性肽鍵的不可逆結合，對去除異味具有重要的意義。風味的釋放實際上是風味化合物在凝膠網絡中的擴散過程，該過程與凝膠網絡的結構性質、底物的種類相關。在牛乳的風味研究中，復合使用TGase與超高壓技術，發現風味的組成和含量有了明顯的改善[37]。這可能是因為其協同作用導致了一些活性位點的暴露。在小麥蛋白的滋味研究中，TGase與超聲的復合使用，可以促進蛋白酶解液釋放出更多的鮮甜味呈味物質[38]。但是僅單獨的TGase交聯的酶解液滋味評分較低，這可能是因為酶交聯使得胰蛋白酶酶切位點掩蔽在內部，無法被酶切成小分子肽類。在牛肉粒的加工過程中，添加TGase，可以在一定程度上減少游離氨基酸的損失，增加風味前體物的含量，在后期的加工過程中表現出更多的特征風味[39]。但風味的釋放與蛋白凝膠網絡結構的內在關系還未被深入探究，可從凝膠網絡結構的角度來闡述風味的控釋機理。

酶催化酰基轉移反應，可取代傳統的糖基化反應，WANG等[40]研究了TGase的添加量對晚期糖基化終產物(advanced glycation end-products,AGEs)形成的影響，發現在TGase與殼寡糖的添加比例為1∶1(質量比)時，可抑制AGEs的形成，避免對產品色澤、營養和風味的破壞。TGase催化糖基化對抑制水產品中AGEs的形成是有效的，可進一步探究，使其成為一種有效合理的方法。

3 轉谷氨酰胺酶與其他技術復合使用

3.1 物理技術

3.1.1 超聲

超聲輔助技術是食品蛋白改性中常見的一種技術，超聲的空化效應產生的瞬時高溫、高壓，使蛋白的空間結構展開，破壞分子間的氫鍵，改善表面疏水性。食品經適當的超聲預處理后，再經TGase改性，可有效改善食品的功能特性與風味。

采用超聲[41]與TGase復合使用，提高了大豆-乳清混合蛋白的交聯度、凝膠硬度、持水力。在預超聲后，蛋白內部結構展開，暴露出更多的疏水結構，有利于酶的交聯，形成更多的二硫鍵，從而形成致密規則的凝膠網絡結構，提升持水力。其原因主要有以下幾點：(1)在改性過程中，超聲波空化引起氣泡破裂，使得氣泡周圍區域的局部壓力和溫度升高，從而導致蛋白展開及肽鍵斷裂，親水性氨基酸殘基暴露在水中，溶解度提高。(2)超聲處理減小了大豆分離蛋白的粒徑，蛋白構象發生改變，導致蛋白表面疏水性和游離巰基增加；這有利于TGase交聯，形成可溶性蛋白聚集體，增強了蛋白-水的相互作用，提高了蛋白溶解度。(3)經超聲和TGase催化后的凝膠蛋白較空白組對比后，能夠形成致密的凝膠網絡結構，這主要是因為蛋白分子發生交疊作用，縮小了彼此間的距離，使得網孔細小且均勻[42-44]。

風味的改善是利用酶法聚合及酶法降解雙重改性方式，提高酶解蛋白呈味物質的釋放量。在120 W超聲15 min后，進行TGase交聯5 h，小麥面筋蛋白-酵母混合液經酶解后的鮮味評分顯著提高[38]。呈味肽物質提升，可能是由于超聲后，β-轉角降低，天門冬氨酸和谷氨酸是與其相關的氨基酸，即說明天門冬氨酸和谷氨酸被轉換成為β-折疊和無規則卷曲這樣的伸展結構，改變了蛋白的柔韌性，促進酶與胰蛋白酶酶切位點的結合，降解出更多的呈味肽；其次，也可能是因為酵母內源酶在TGase存在的交聯環境下，發揮了催化作用，使超聲后的蛋白結構更易被胰蛋白酶水解；此外，交聯可能使超聲后的蛋白再次發生了結構變化，酶切位點變得更加敏感，呈味物質被更好的釋放出來。

3.1.2 微波

微波與TGase的聯合使用包括3種方式：(1)對食品進行微波預處理后再進行適當的酶改性；(2)微波輻射TGase后，改性后的酶對食品進行催化；(3)同時進行微波輻射與酶改性。

秦新生[43]利用微波對大豆-小麥混合蛋白進行預處理后，再經TGase交聯改性時發現，混合蛋白凝膠的凝膠強度、持水力得到顯著提高。凝膠強度提升的主要原因為，在水中，微波對蛋白中的極性分子產生高頻率振蕩作用，使微波場能轉化為熱能，蛋白質溫度升高，從而使得蛋白質分子間(內)的非共價鍵斷裂，蛋白質二級、三級結構被破壞，空間結構變得疏散；這有利于酶交聯，促進二硫鍵的形成及分子間的相互作用。其次，微波的極化效應，減小了蛋白的分子粒徑，有利于形成致密均勻的微觀結構。蛋白-水的相互作用增加，微波加熱時的能量促進二硫鍵的形成，提升持水力[45]。

微波改性酶時發現，微波能改變TGase的空間結構，提高酶活，但是復合使用不一定能夠產生協同效應[46]。使用微波輻射TGase，酶活相比于普通水浴提高了4.38%，微波輻射展開了酶的結構，暴露出更多的結合位點。對乳蛋白進行微波與TGase的復合改性研究時發現，同時使用可提高乳蛋白的聚集度、提升交聯速度[47]。單獨使用TGase時，乳清蛋白和酪蛋白聚合的時間較長；復合使用時，縮短了近1/3的時間；這可能是由于微波不僅提升了酶活，且輻射使蛋白結構展開，促進了TGase的交聯作用。而有學者利用微波處理后的TGase進行催化肌原纖維蛋白時發現，其凝膠強度卻低于水浴處理結果；這是與電磁場的快速變化阻礙了肌原纖維蛋白的展開及溶解，以及系統中生成了較多的二硫鍵進一步形成了空間位阻阻礙了酶的催化有關。

3.1.3 超高壓

超高壓技術被常被用作物理的非熱加工的一種保藏技術。在近年來的研究中發現，超高壓誘導膠凝作用，且相比于熱誘導凝膠，具有更好的凝膠穩定性。在200～300 MPa時，高壓誘導的魚糜凝膠具有更好的持水力，且在貯藏過程中，凝膠的穩定性有所提升。

超高壓技術與TGase聯合使用時，魚糜的凝膠強度、持水力顯著增加；相比于單使用超高壓或酶，聯合使用時共聚物更多，產生協同效應[48]。但未說明超高壓技術對酶空間構象的改變，可進一步深入探究超高壓對酶內部結構的影響。QIN等[45]研究發現超高壓對大豆分離蛋白/小麥蛋白預處理后，經TGase誘導交聯的凝膠特性得到明顯提高；在100～400 MPa的超高壓預處理10 min后，大豆分離蛋白/小麥蛋白發生展開，使巰基及疏水性基團暴露在蛋白表面，升高了β-折疊和無規則卷曲的含量，促進了TGase交聯，凝膠的儲能模量提高、持水力增加，凝膠強度提高。在對小麥面筋蛋白乳液凝膠性質的研究時發現，超高壓預處理有效降低油滴粒徑、增加了比表面積，促進TGase交聯，形成分子間/分子內的交聯，使其形成均勻致密的凝膠網絡結構，提高芳香物質的貯存穩定性，這對研究魚糜風味的釋放及香味物質的包埋具有一定的意義[49]。

3.2 化學交聯劑

TGase與γ-聚谷氨酸復合使用時，二者存在協同作用，凝膠性及彈性改善效果優于單獨使用的改善效果[50]。這是因為在復合使用時，γ-聚谷氨酸降解后暴露出Glu殘基，TGase催化Glu殘基與Lys殘基交聯，形成更多的非二硫共價鍵，而非二硫共價鍵與疏水相互作用在凝膠的三維網絡結構中是維持有序的網絡結構的主要作用力。ZHANG等[51]發現羧化納米纖維素與TGase復合使用時，由于納米纖維素的納米尺寸使親水基團暴露更多，且暴露的羧基的吸水力提高了蛋白的持水性，使得凝膠結構更加致密、凝膠強度增加。綜上，化學交聯劑通常與TGase具有協同作用，可改善凝膠質地，在復合凝膠或重組肉制品中有較好的應用前景。

4 展望

TGase作為蛋白質交聯劑，可以改善食品功能特性、生化特性，提高凝膠性、持水性、乳化性等，降低致敏性、消化率，產生多種生物活性肽。但仍有一些問題有待進一步研究，目前對TGase的應用研究多集中在提高蛋白的功能特性上，酶交聯的酰基轉移反應、脫酰胺基反應研究較少，可加強對營養價值、風味釋放及吸附方向上的研究；復合技術的使用也成為現階段的研究熱點，微波可提高TGase酶活，高壓可提升TGase的交聯度，輻射與TGase有協同作用，未來可以將TGase與其他新型物理技術聯合使用提高蛋白功能特性；利用酶交聯，將廉價植物蛋白與低值的碎肉重組可提升產品的營養價值及商業價值，為重組肉制品的發展提供參考。