濃香型白酒生態系統中己酸菌研究進展

張曉宇，郭子賢，呂育財，任立偉，龔大春，楊瀟，陳萍，郭金玲*

1(三峽大學 生物與制藥學院，湖北 宜昌，443002)2(湖北省生物酵素工程技術研究中心(三峽大學)，湖北 宜昌，443002) 3(湖北稻花香酒業股份有限公司，湖北 宜昌，443112)

中國白酒按香型可分為濃香型、醬香型、清香型、鳳香型和其他香型等[1]。其中，濃香型白酒以其“窖香優雅、綿甜爽凈、酒體柔和協調”的特點深受消費者喜愛[2]。濃香型白酒生產是以高粱、玉米、糯米、小麥、大米5種糧食為主原料，在棲息于窖池中大量微生物的參與下，采用混蒸續渣工藝進行的多菌種混合固態發酵[1]。

經過長期發酵馴化，窖池中棲息著包括梭菌綱、擬桿菌綱、芽孢桿菌綱、甲烷桿菌綱、甲烷微菌綱等在內的多種厭氧微生物[1]。研究發現，濃香型白酒中風味化合物的組成是由其微生物多樣性決定的[3]。據報道，濃香型白酒含有1 300多種不同的風味化合物[4]，其中，己酸乙酯是使濃香型白酒風味獨特的主要呈香物質，其含量直接影響濃香型白酒的價值和品質[1]。己酸乙酯是由己酸和乙醇經過酯化反應的產物[4]，含量與窖池生態系統中的己酸菌密不可分，因此，己酸菌被普遍認為是濃香型白酒釀造中最重要的一類功能微生物[1-2]。

自發現濃香型曲酒主體香味成分為己酸乙酯以來，國內對窖池中己酸菌的研究在各酒廠陸續展開[5]。目前，對于己酸菌的研究主要集中在窖池生態系統中新型高效己酸菌的篩選[2, 6]、發酵條件調控[7- 8]、己酸代謝途徑解析[9-10]、己酸菌在濃香型白酒釀造[5, 11]及其他領域的應用等[12-13]。本文針對濃香型白酒生態系統中己酸菌及其特性、己酸代謝途徑、己酸菌應用等方面綜述濃香型白酒己酸菌研究進展。

1 己酸菌種類及特性

己酸菌是能夠以乙醇、乳酸、葡萄糖、D-半乳糖醇等為碳源，發酵積累己酸的一類微生物的總稱。目前已報道的己酸菌主要為來自于梭菌綱梭菌屬、梭菌綱瘤胃菌科及Negativicutes綱巨球型菌屬細菌。己酸菌在環境系統中分布廣泛，濃香型白酒生態系統、厭氧消化污泥、牛羊瘤胃和淤泥等中均有己酸菌存在。

1.1 來源于濃香型白酒生態系統的己酸菌及其特性

表1列出了部分分離于濃香型白酒生態系統的己酸菌種類及特性。

表1 分離于濃香型白酒生態系統的己酸菌種類及特性Table 1 Species and characteristics of caproic acid-producing bacteria isolated from strong-flavor Baijiu ecosystem

1.1.1Clostridiumkluyveri

C.kluyveri是具于代表性的己酸菌，在白酒窖泥、淤泥沉積物以及牛瘤胃中廣泛存在[14]。BARKER[14]用乙醇和CO2為基質研究甲烷菌時發現一種鼓槌孢子型產己酸的菌株，產物為己酸、乙酸、丁酸。1942年被正式命名為C.kluyveri，C.kluyveri菌株專性厭氧，菌落形態呈圓形不規則狀，菌落呈乳白色，邊緣呈波狀，表面光滑或突臍狀，最適生長溫度為30～35 ℃，在pH為7.0以上的堿性條件下生長良好。該菌以乙醇為電子供體，以醋酸鹽和琥珀酸鹽為電子受體[9]，不能利用葡萄糖、乳糖等糖類，在發酵過程中產生氣體。此外，C.kluyveri以乙醇和琥珀酸為底物，產生乙酸酯、丁酸酯和己酸酯[15]；以乙酸和丙醇為底物，產生丙酸、戊酸、己酸和庚酸[16]。

1.1.2Clostridiumsp

隨著生物技術的發展，對于菌株分類越來越科學細致。各個酒廠窖泥中都分離出不同產己酸的梭狀芽孢桿菌[6, 17-20]，菌體往往吸附在碳酸鈣上，但在沒有碳酸鈣的條件下產己酸含量未下降，且多加碳酸鈣不能提高己酸產量[1, 6]。除此之外，朱曉軍[2]發現瘤胃球菌科梭菌屬第Ⅳ簇單菌H2以葡萄糖為電子供體，根據實驗現象猜測實際的濃香型白酒釀造體系中，C.kluyveri可能并不是己酸合成唯一的貢獻者。

1.1.3Ruminococcaceaebacterium

ZHU等[6]在分批補料發酵反應器中首次發現了利用乳酸高產己酸的菌株R.bacterium CPB6，在窖泥中發現該菌株屬于Ruminococcaceae家族IV型梭狀芽孢桿菌，以乳酸為電子供體[18]。該菌株最適pH為5.0～6.5，溫度為30～40 ℃，可利用淀粉、麥芽糖、葡萄糖、丙酮酸等[19]。己酸生產和梭狀芽孢桿菌簇IV之間為正相關關系[2]。目前對于產己酸梭狀芽孢桿菌IV的代謝途徑中鏈延長的基因和關鍵酶研究不多，有待完善。

1.1.4 濃香型白酒生態系統中其他己酸菌

除了以上幾項研究得到的濃香型白酒生態系統中的常見己酸菌，趙輝等[20]在濃香型白酒窖泥中發現3株高產己酸的菌株BacillusmegateriumC78、Bacillusfusiformisa57及BacilluslicheniformisA17，相應最適pH值分別為7.0、6.5、7.0，最適溫度分別為34、34、37 ℃。

1.2 來源于其他生態系統的己酸菌及其特性

己酸菌除了存在于在濃香型白酒生態系統中，在其他生態系統中關于己酸菌的研究也越來越多，如表2所示。

表2 分離于其他生態系統的己酸菌種類及特性Table 2 Species and characteristics of caproic acid-producing bacteria isolated from other ecosystems

1.2.1Megasphaeraelsdenii

1.2.2Clostridiumsp. BS-1

從淤泥中篩選以D-半乳糖醇為碳源的厭氧微生物，過程中發現新型梭狀芽孢桿菌IV屬產己酸菌BS-1[24]，后來被重新命名為Caproicproductensgalacitolivorans[25]；該菌株也可利用葡萄糖產己酸，但是己酸產量低于以半乳糖醇為底物時的產量。

1.2.3Eubacteriumlimosum

E.limosum是一種從綿羊瘤胃液中分離到褐桿菌，通過檢測耐熱性，未觀察到孢子[26]。該菌以甲醇、醋酸鹽、半胱氨酸等為底物，當以甲醇、丁酸、CO2為原料對其進行培養時，己酸成為主要產物，且丁酸的產生與甲醇氧化的通量密切相關[23]。

1.2.4Eubacteriumpyruvativorans

WALLACE等[27]用胰酪蛋白水解物作為唯一碳源和能源，從綿羊瘤胃液中分離出以乳酸和乙酸為碳源的己酸菌E.pyruvativorans。其不是糖化菌，不利用乙醇且不完全利用乳酸，是利用丁酸和丙酸生成己酸和戊酸的細菌，利用丙酮酸通過反向β氧化途徑獲得ATP。

2 己酸菌的己酸代謝途徑及代謝調控

2.1 己酸代謝途徑

研究表明，某些厭氧細菌(如梭狀芽孢桿菌)能夠利用脂肪酸合成酶復合酶通過反向β氧化途徑延長短鏈脂肪酸[9-10]。如圖1所示，以乙醇為電子供體，在乙醇氧化偶聯階段消耗NAD+產生大量的還原型輔酶Ⅰ(nicotinamide adenine dinucleotide, NADH)生成乙酰輔酶A，通過底物水平磷酸化產生乙酸；當以乳酸為底物時，在乳酸氧化階段代謝產生NADH和乙酰輔酶A[28]。羧酸鏈延長過程中產生的還原型輔酶Ⅰ(nicotinamide adenine dinucleotide, NADH)為合成己酸代謝過程中提供H+并促進電子流動，且代謝過程中乙酰輔酶A通過底物水平磷酸化促進ATP產生，為羧酸鏈延長提供能量[10]。

圖1 以乙醇和乳酸為電子供體的己酸代謝途徑[30]Fig.1 Metabolic pathway of caproic acid with ethanol and lactic acid as electron donors 注：NADH為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的還原態，還原型輔酶Ⅰ；NAD+為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸；NADPH為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸， 是一種輔酶，即還原型輔酶Ⅱ；NADP+為煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸，是還原型輔酶Ⅱ(NADPH)的氧化形式；ATP為腺嘌呤核苷三磷酸 (簡稱三磷酸腺苷)；ADP為二磷酸腺苷；Fdox為氧化的鐵氧化還原蛋白；Fdred為還原的鐵氧化還原蛋白

研究得知，在反向β氧化的羧酸鏈延長反應中，碳水化合物初級厭氧發酵重要中間體乙醇和乳酸是己酸合成過程中有效的還原劑，且為最理想的電子供體[29]。鏈延長過程中的必要條件是存在大量還原性化合物為其提供能量和電子供體，如乙醇和乳酸等。

2.2 產己酸代謝途徑競爭途徑

在混合培養過程中，由于受到競爭途徑的影響會導致鏈延長過程的穩定性降低，產己酸代謝途徑的競爭路徑如表3所示，此外，圖1所示的丙烯酸酯合成丙酸鹽途徑也為產己酸代謝途徑的競爭途徑[31-32]。

表3 產己酸代謝途徑競爭途徑Table 3 Competitive pathway of caproic acid metabolism

乙酸營養型甲烷的形成是通過消耗鏈延長的底物乙酸形成甲烷，乙酸消耗的過程與產己酸代謝途徑形成競爭關系；中鏈脂肪酸消耗乙醇氧化為乙酸鹽獲得能量，這與其他生物消耗乙醇過程形成競爭關系；最終產物中鏈脂肪酸也會在脂肪酸氧化劑的作用下發生降解，造成產品的流失。丙烯酸酯競爭途徑如圖1所示，將乳酸轉化為丙酸酯[32]，在以乳酸為底物的M.elsdenii純培養中丙烯酸酯競爭途徑得到證實，并未生成己酸，發現在M.elsdenii對酸的利用中輔酶A轉移酶活性發揮核心作用[33]；研究表明，M.elsdenii不能利用葡萄糖產丙酸鹽的主要原因是乳酸可以誘導合成乳酸外消旋酶，然而葡萄糖發酵的細胞不能合成乳酸外消旋酶[32]。因此，為得到高效產己酸代謝途徑需要對其競爭途徑加以控制以保證生產需求。

2.3 己酸菌的己酸代謝調控

通過乙醇氧化途徑產己酸的微生物一直面對的主要問題是乙醇對微生物有一定的抑制作用，但用低濃度乙醇易導致己酸濃度低，經濟效益不佳。除乙醇濃度會影響己酸產量，以乙酸和丁酸的混合物作為底物可以有效提高己酸產量[7]。DIENDER等[34]研究發現乙酸可促進中鏈脂肪酸合成，但是其具體功能仍不明確。

基于乙酸和乙醇含量對己酸產量的巨大影響，很多學者開始乙酸和乙醇濃度比與己酸產量關系的研究。YIN等[8]研究發現乙酸和乙醇濃度比與己酸的產量呈負相關，且發酵產己酸過程中必須有乙酸。但WEIMER等[9]和LIU等[35]的研究結果恰恰相反，推測乙酸的減少可能抑制己酸的生產。混菌培養產己酸過程中乙醇和丙酸的濃度比也會影響己酸產量，PIETER等[36]研究發現C.kluvveri與奇鏈延長混合菌群共同培養時，研究丙酸乙醇濃度比對最終產物光譜的影響，發現乙醇氧化成乙酸的量受乙醇和丙酸濃度比的影響，故乙醇、丙酸的比例高則會導致產物專一性較低，這一研究有利于任何乙醇驅動的鏈伸長反應。

通過乳酸氧化途徑生產己酸的菌株中，乳酸含量會影響產物產量。研究發現以乳酸為唯一碳源和電子供體的產己酸菌株若最初乳酸含量過高，則最終產物會發生改變，變成丙酸；但是降低乳酸濃度后卻沒有發現己酸的積累，這一現象引發KUCEK等[37]的注意，認為初始乳酸值過高，乳酸轉化為乳酰輔酶A，隨后反應生成丙酰輔酶A促使丙酸生成。且當L-乳酸鹽積累到誘導形成乳酰輔酶A時，由乳酸導向丙酮酸和偶數鏈延長產物將會很難實現，因此通過控制最初乳酸濃度對乳酸合成己酸的途徑代謝控制十分重要。

2.4 己酸代謝途徑的構建

Na-Rae[38]利用基因組尺度代謝網絡重建技術構建M.elsdeniii基因組尺度代謝模型，更好地解析了在M.elsdeniii中己酸合成代謝途徑。通過KEGG和Biocyc數據庫中的代謝途徑和生化反應初步構建在M.elsdeniii中己酸合成的基因組尺度代謝網絡，經過通量分析模擬細胞代謝，研究不同細胞生長狀態下產生己酸的分叉通路的通量分布，重建了己酸合成的基因組級代謝模型M.elsdeniiiME375。研究提出3種酶：乙酰輔酶A水解/轉移酶(acetyl-CoA hydrolase/transferase, cat)、鐵氧化蛋白氧化還原酶和4-羥基丁基輔酶A脫水酶(4-hydroxybutyryl-CoA dehydratase, abfD)的存在可能會影響M.elsdenii最終產物的碳長度，而且以上這些酶都有助于酰基輔酶A的延長。最終，利用計算機模擬技術分析碳產量和氧化還原平衡，綜合各種因素選擇己酸高產代謝途徑。

在代謝過程中，合成的丁酰-輔酶A可以通過β-酮硫解酶(β-ketothiolase, BktB)、3-羥基丁基輔酶A脫氫酶(3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase, Hbd)、巴豆酸酶(crotonase, Crt)和反式烯酰輔酶A還原酶(trans-enoyl-CoA reductase, Ter)生成己酰-CoA[37]。CHEON等[39]首次構建由5～7個基因組成的產己酸通路，并將其整合進酵母菌株染色體中。通過修改己酸產量不穩定的1-己醇途徑，采用了另一條鏈延長途徑來保證穩定的己酸產量，并報道了一種新型有利于鏈延長的酶丙二酰輔酶A-酰基載體蛋白轉酰酶(malonyl CoA-acyl carrier protein transacylase, MCT1)。通過整合7個基因乙酰輔酶A乙酰轉移酶(acetyl CoA acetyltransferase, AtoB)、BktB、Crt、MCT1、Hbd、酰基輔酶A硫酯酶(acyl-CoA thioesterase, TES1)、Ter形成5個組合，完成在Kluyveromycesmarxianus中己酸通路的構建，其中重組菌株H4A以半乳糖為底物生成己酸。

3 濃香型白酒生態系統中己酸菌與其他微生 物的關系

在濃香型白酒生態系統中，主要的產己酸微生物梭菌屬細菌間，以及梭菌屬細菌與其他微生物間存在種間相互作用。普遍認為，存在一種梭菌屬細菌的產物可作為另一梭菌屬細菌底物的種間互補代謝物質。例如，Clostridiumljungdahlii可以同化CO2和H2產生C.kluyveri發酵產己酸所需要的乙酸和乙醇[40]。此外，己酸菌與其他微生物存在物種間的氫轉移。例如，甲烷菌可消除對己酸菌代謝產生反饋抑制作用的物質[41]，因此，甲烷菌和己酸菌共培養時己酸產量提高[16]。然而，乳酸桿菌豐度與己酸生產呈負相關，高豐度的乳酸菌可以通過降低環境pH值、積累乳酸或分泌各種細菌素來抑制梭菌屬微生物[42]。

研究發現，酵母菌與己酸菌共培養可有效促進己酸生產。嵇翔等[43]將C.kluyveri與釀酒酵母進行了混合培養，產量較純培養提高了12.5%，釀酒酵母發酵過程中消耗氧氣，促進丁酸產生和轉化，提高己酸產量。萬朕[5]研究得到相同結果，將己酸菌、丁酸菌以及酵母菌按照一定的比例混合成養窖菌液，可促進己酸生產。

作為固氮微生物的放線菌在與己酸菌共培養時可以提供氮源，放線菌產生的黑色素是產己酸的促進因子。曹新志等[44]將己酸菌和放線菌共培養，發現高濃度放線菌與己酸菌共培養會降低己酸的產量。欒興社[45]發現鏈霉菌對己酸菌產己酸和產酯酵母生長都具有促進作用，且該菌具有較強的利用硫和硫化物的能力，提高了酒品質并為窖泥脫臭提供了新的生物技術。

4 己酸菌的應用

4.1 己酸菌在濃香型白酒釀造中的應用

窖泥質量關系著濃香型白酒的質量，窖泥是微生物發酵的溫床，一般己酸菌在工業生產中的應用是通過調節窖泥中微生物微生態來實現的，根據窖泥中己酸菌的豐度及其產己酸能力使發酵過程中己酸乙酯含量不同，從而改善白酒品質，提高白酒在市場中的競爭力。

4.1.1 人工窖泥

人工窖泥的構建大部分是將分離出的己酸菌菌液加入窖泥、黃土、老窖泥、曲粉等中，并按照一定配比混合。將Clostridiumguangxiensestrain xsk1作為己酸菌來源進行應用，黃泥、粉末活性炭和顆粒活性炭載體人工窖泥己酸菌數量達到2.08×106 CFU/g[17]。魯少文等[11]利用瘤胃科梭菌CPC-11制作人工窖泥并投入生產發酵35 d時，己酸乙酯含量較初始含量提升了2.74倍。

4.1.2 濃縮復合己酸菌液

濃縮復合菌液可以有效提高己酸含量，萬朕[5]從窖泥中分離出來一株丁酸菌和一株己酸菌，發現丁酸菌在有醋酸鹽和乙醇存在的培養基中產己酸。確定酯化最佳條件將產丁酸菌、產己酸菌及酵母2∶2∶3混合制成復合菌液投入生產，由最初3 100個己酸菌/g窖泥提高至48 000個己酸菌/g窖泥，達到增加己酸產量改善白酒品質的目的。科研工作者對于濃縮復合菌液[25, 28]應用于實際的研究越來越多，在工業生產中發揮出一定的積極作用。

4.2 己酸菌在其他領域的應用

己酸可通過一系列酮化和脫氫過程轉化為燃料，生成的烷烴作為可以與其他化學物質混合生產生物柴油[10]。除發酵己酸外，己酸菌在廢物利用方面具有廣泛的應用，可將生活廢料轉化為能源為環境保護做出貢獻。最新研究發現，以果蔬廢棄物為原料，通過鏈延長將短鏈羧酸轉化為中鏈羧酸達到果蔬垃圾的高利用度的生物處理[12]。菌株Clostridiumcarboxidivorans、Clostridiumragsdalei和Clostridiumljungdahlii可以從廢料的氣化或熱解中獲得乙醇和丁醇，Clostridiumbeijerinckii可以利用木質纖維素生成異丙醇和丁醇，Clostridiumbutyricum可以利用染料工業的副產物甘油高產1,3-丙二醇[13]。

5 展望

隨著釀酒產業的發展，人們逐漸把目光投向重要功能性釀造微生物的研究，為己酸菌創造一個良好的生態環境，以達到促進濃香型白酒呈香物質己酸乙酯形成的目的。釀酒產業逐漸和生物科學技術相結合，出現很多關于己酸菌的分離篩選和菌株理化性質、代謝性質的研究。

關于己酸菌應用于窖池進行微生物結構調整達到提高酒品質的研究目前還不夠全面，應該更加關注：(1)通過己酸菌代謝特征研究，從代謝途徑進行研究提高己酸產量；(2)研究己酸菌共生菌株的代謝特征，尋找“增己降乳”菌株及代謝途徑。并研究各個菌株代謝底物及中間代謝產物互相之間的關聯性和協同性。

在掌握己酸菌基礎理化性質和代謝特征的基礎上，摸索產己酸能力強的菌株的最優培養條件，剖析己酸菌與其他菌株的共生關系，才能對護窖窖泥、提高酒品質菌液的配制準確把握。模擬固態發酵過程，觀察微生態變化，將產己酸復合菌液投入生產應用實際，既可以使釀酒過程更加規范化、合理化、科學化，又可以應用于新窖池使窖泥中微生態不用經過漫長時間沉淀而迅速形成，提高工作效率；調整老化窖池的微生物結構，并為優化窖池窖泥途徑和方法的探究提供堅實的理論基礎。