蜘蛛香環(huán)烯醚萜類成分對(duì)急性脊髓損傷大鼠神經(jīng)細(xì)胞焦亡的影響

王靜怡，尹杰，劉建成，龐日朝，王文春

1.西南交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，四川成都市 610031；2.中國(guó)人民解放軍西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，四川成都市610083

脊髓損傷是一類極具危害的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，生活中常由高處跌落、摔倒和車禍等外界因素造成，一旦發(fā)生，會(huì)在損傷部位產(chǎn)生瞬間損害，繼而引發(fā)損傷節(jié)段以下神經(jīng)感覺(jué)傳導(dǎo)受阻或缺失以及運(yùn)動(dòng)功能障礙的產(chǎn)生[1-2]。脊髓損傷極高的致殘率，對(duì)患者的身心健康、生活質(zhì)量及其家庭乃至社會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重影響[3-4]。同時(shí)，脊髓損傷在全世界范圍內(nèi)發(fā)病率較高，每百萬(wàn)人口中約有10.4～83例[5]。目前臨床上仍未找到適用于脊髓損傷的確切、安全及有效的治療方法[6]。因此，尋找有效的藥物用于脊髓損傷治療意義重大。

中草藥蜘蛛香的應(yīng)用歷史極為久遠(yuǎn)，其環(huán)烯醚萜類主要成分已被發(fā)現(xiàn)在抗焦慮[7-8]、抗抑郁[9]、抗氧化[10]和神經(jīng)保護(hù)[11]等方面有積極作用。蜘蛛香環(huán)烯醚萜類可促進(jìn)傷后大鼠運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)，改善繼發(fā)性炎癥反應(yīng)以及氧化應(yīng)激等病理程度[12-13]。而對(duì)急性脊髓損傷繼發(fā)性損害的減輕一直是研究的要點(diǎn)，炎癥反應(yīng)作為繼發(fā)損害的關(guān)鍵因素之一，會(huì)產(chǎn)生大量促炎因子白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-18，以及蛋白酶等加速神經(jīng)細(xì)胞的死亡[14]。焦亡是目前細(xì)胞炎性死亡的研究熱門方向，在脊髓繼發(fā)性損傷發(fā)生后，細(xì)胞內(nèi)外的毒性分子會(huì)誘導(dǎo)炎性體的形成，其中報(bào)道較多的炎性小體是NLRP3，一旦被激活可觸發(fā)下游分子的活化，引發(fā)細(xì)胞焦亡，釋放更多的炎性因子，放大炎癥效應(yīng)[15]。蜘蛛香環(huán)烯醚萜類在脊髓損傷后對(duì)繼發(fā)性炎癥的抑制，是否與減輕神經(jīng)細(xì)胞焦亡有關(guān)是個(gè)值得探討的問(wèn)題。

本研究旨在觀察蜘蛛香環(huán)烯醚萜類在急性脊髓損傷后對(duì)神經(jīng)細(xì)胞焦亡的影響，以發(fā)現(xiàn)該藥物在神經(jīng)保護(hù)方面的更多可能機(jī)制，為蜘蛛香藥物在脊髓損傷的臨床應(yīng)用提供更多基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康雄性Sprague-Dawley 大鼠24 只，體質(zhì)量250～280 g，購(gòu)于成都達(dá)碩生物科技有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào)SCXK(川)2015-030。保持飼養(yǎng)環(huán)境清潔及通風(fēng)，室溫(22±2)℃，空氣相對(duì)濕度為60%，12 h 明暗交替，自由飲食。

隨機(jī)數(shù)字法將大鼠分為假手術(shù)組、模型組和治療組，每組8只，每籠4只分籠飼養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后造模。本實(shí)驗(yàn)所有操作均遵循中國(guó)人民解放軍西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院倫理委員會(huì)的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1蜘蛛香藥物

于貴州省遵義市藥材市場(chǎng)進(jìn)行采購(gòu)，由西南交通大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院宋良科副教授鑒定為蜘蛛香藥材，儲(chǔ)存在陰涼通風(fēng)處[16]。

1.2.2主要試劑

一步法TUNEL檢測(cè)試劑盒(綠色熒光)：江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。大鼠IL-1β和IL-18 ELISA 檢測(cè)試劑盒：上海江萊生物科技有限公司。重組GSDMD 抗 體(ab219800)、NLRP3 抗 體(ab214185)、pro Caspase1+p10+p12 抗體(ab179515)、HRP 標(biāo)記羊抗兔IgG 抗體(ab6721)：美國(guó)ABCAM 公司。GAPDH 抗體(10494-1-AP)：武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.2.3主要儀器

醫(yī)用動(dòng)脈瘤夾：德國(guó)貝朗。施夾鉗：德國(guó)雷伯公司。精密電子天平：瑞士PRESRCA。冰凍切片機(jī)：美國(guó)ThermoFisher 儀器有限公司。酶標(biāo)儀：日本SANYO 公司。高速冷凍離心機(jī)：美國(guó)THERMO 公司。熒光顯微鏡：德國(guó)ZEISS。DYY-6C 電泳儀、UVTransilluminator 化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀：美國(guó)BIORAD公司。

1.3 方法

1.3.1藥物制備

藥物提取方法參考孫勇[9]的文獻(xiàn)。稱取蜘蛛香藥材初步研磨為粉，經(jīng)70%乙醇作兩次浸提處理：粗粉8 倍量乙醇浸泡1 d，收集浸液；換6 倍量乙醇繼續(xù)浸泡粗粉殘?jiān)?2 h；收集全部浸液進(jìn)行減壓濃縮處理得粗浸膏。純化過(guò)程利用大孔樹(shù)脂進(jìn)行，所得洗脫液進(jìn)一步減壓濃縮，40 ℃真空干燥處理得浸膏。高效液相色譜分析法測(cè)得蜘蛛香環(huán)烯醚萜類成分的純度為71.5%。

藥物溶液(1 mg/ml)配制：稱取上述提取物0.5 g，以0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液作為溶質(zhì)進(jìn)行超聲震蕩溶解，使蜘蛛香藥物在其中均勻混懸，繼續(xù)加入CMC-Na 溶液定容到500 ml，得到青黃色混懸液。4 ℃密封避光保存。

1.3.2模型制備

采用標(biāo)定閉合力為70 g 的醫(yī)用動(dòng)脈瘤夾鉗夾大鼠T10脊髓制備急性脊髓損傷模型。

模型組和治療組麻醉后，剔除周圍體毛，在操作臺(tái)上將大鼠俯臥固定。先確定T10棘突位置，再沿背部中線做縱向切口約3 cm，逐層分離皮膚及皮下肌肉組織，暴露T9～T11脊椎，去除椎板，將T10脊髓背側(cè)硬脊膜完全暴露出來(lái)。手持施夾鉗裝固好動(dòng)脈瘤夾，從垂直于大鼠脊髓的方位由T10脊髓側(cè)邊置入，使完全橫跨T10脊髓，松開(kāi)施夾鉗，鉗夾10 s 后撤出動(dòng)脈瘤夾。手術(shù)部位經(jīng)常溫生理鹽水沖洗后用棉球吸除溶液，縫合消毒。

假手術(shù)組除脊髓不做鉗夾損傷，其他操作同前。

造模成功的標(biāo)志為鉗夾脊髓時(shí)出現(xiàn)大鼠雙后肢抽搐，尾部痙攣性擺動(dòng)，且術(shù)后觀察大鼠后肢為完全癱瘓狀態(tài)，伴有膀胱功能障礙。

1.3.3術(shù)后護(hù)理及干預(yù)

術(shù)后密切關(guān)注大鼠生命體征，大鼠自主排尿功能喪失，需每天人工輔助導(dǎo)尿3 次，至膀胱功能恢復(fù)。前3 天每天腹腔注射青霉素20 萬(wàn)U。整個(gè)飼養(yǎng)期間注意勤換墊料，清洗擦拭大鼠腹部及后肢，保持干燥。

術(shù)后4 h 待大鼠蘇醒，生命體征穩(wěn)定，進(jìn)行灌胃給藥，每天1次，連續(xù)7 d。治療組灌胃配置好的蜘蛛香環(huán)烯醚萜類溶液10 mg/kg[12]。模型組和假手術(shù)組灌胃同等劑量CMC-Na溶液。

1.3.4觀察指標(biāo)及檢測(cè)

1.3.4.1HE染色

每組選取4 只大鼠采集脊髓組織制備病理切片。選用經(jīng)心灌注固定取組織的方法[17]，10%水合氯醛3.5 ml/kg 腹腔注射麻醉，仰臥固定在手術(shù)臺(tái)上，打開(kāi)胸腔使心臟完全暴露，由左心室剪開(kāi)一小口插入灌注針，先以生理鹽水約150 ml快速灌流15 min左右，再換用4%多聚甲醛固定液繼續(xù)灌注固定，調(diào)整流速先快后慢直至大鼠軀干四肢及尾部僵硬時(shí)停止。取材時(shí)以T10損傷處為中心，截取其前后0.5 cm 范圍脊髓組織，總長(zhǎng)約1 cm，放置于固定液中，4 ℃過(guò)夜。待組織梯度脫水完畢后，OCT包埋，冰凍切片機(jī)切片，厚15 μm，后行HE 染色。于臺(tái)式顯微鏡下觀察組織全貌，再換病理顯微鏡20、40倍物鏡下觀察損傷區(qū)病理情況。使用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析系統(tǒng)計(jì)算每張切片上脊髓組織損傷空洞部分單位面積占比。

殘存面積所占百分比=(1-損傷部位空洞面積占比)×100%

1.3.4.2TUNEL熒光染色

選取制備好的切片，TUNEL 染色實(shí)驗(yàn)步驟根據(jù)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。切片經(jīng)固定通透等預(yù)處理后，按照說(shuō)明書(shū)配制反應(yīng)混合液，依步驟進(jìn)行滴加。染色封片后在熒光顯微鏡下進(jìn)行鏡檢，在高倍鏡下，每張切片選取6 個(gè)視野用于測(cè)定TUNEL 陽(yáng)性(綠色)和細(xì)胞核(DAPI，藍(lán)色)數(shù)。

1.3.4.3ELISA

每組取4 只大鼠用于取血，麻醉后，促凝管心尖取血3 ml左右，離心取上清進(jìn)行檢測(cè)。具體實(shí)驗(yàn)步驟按照ELISA 試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。血清及試劑恢復(fù)至室溫后，在包被IL-1β、IL-18 抗體的96 孔板中分別加入相應(yīng)反應(yīng)試劑及樣品，反應(yīng)完畢后立即使用酶標(biāo)儀測(cè)量其吸光度，于450 nm 波長(zhǎng)下讀取記錄相應(yīng)數(shù)值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算濃度。

1.3.4.4Western blotting

選取4只取新鮮脊髓。麻醉后，快速截取以T10脊髓損傷處為中心的1 cm長(zhǎng)組織，根據(jù)蛋白提取試劑盒說(shuō)明加入裂解液及相應(yīng)蛋白酶抑制劑，剪碎后用勻漿器進(jìn)行勻漿，渦旋10 s靜置5 min，重復(fù)3次，全過(guò)程在冰上進(jìn)行，之后離心取上清。BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將蛋白上樣緩沖液按稀釋比例加入蛋白上清中，混勻后煮沸10 min，按20 μg上樣進(jìn)行SDS-PAGE蛋白凝膠電泳，以初始電壓80 V 進(jìn)行電泳，大約30 min 后蛋白遷移到分離膠時(shí)轉(zhuǎn)120 V 電壓繼續(xù)電泳，直至分離出目標(biāo)蛋白或蛋白電泳至凝膠底部。之后根據(jù)目標(biāo)蛋白大小，使用PVDF 膜以恒流300 mA 進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，加入一抗(NLRP3 1∶1000；Caspase-1 1∶1000；GSDMD 1∶1000)，室溫下?lián)u床孵育1 h 后，轉(zhuǎn)入4 ℃靜置過(guò)夜。隔天取出，搖床復(fù)溫1 h，TBST 洗去多余一抗，10 min 3 次，之后加入二抗(1∶1000)，繼續(xù)在搖床上孵育1 h，洗去多余二抗后ECL顯影。在凝膠成像系統(tǒng)中測(cè)定目標(biāo)條帶的光密度值，目的蛋白相對(duì)表達(dá)含量為其積分光密度值比內(nèi)參(GAPDH)積分光密度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用Shapiro-Wilk 檢驗(yàn)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，服從正態(tài)分布以()表示，采用單因素方差分析，并用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩組間比較。不服從正態(tài)分布或方差不齊則采用秩和檢驗(yàn)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行校正。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 HE染色

假手術(shù)組脊髓組織未見(jiàn)病變，其結(jié)構(gòu)完好，內(nèi)部無(wú)壞死空洞產(chǎn)生，灰白質(zhì)結(jié)構(gòu)正常，神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)及分布正常，無(wú)顯著的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)出現(xiàn)。模型組脊髓組織發(fā)生一定程度的組織結(jié)構(gòu)病變，出現(xiàn)大量神經(jīng)元壞死及組織空洞，部分灰白質(zhì)結(jié)構(gòu)模糊，神經(jīng)元構(gòu)造分布紊亂，伴有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，與假手術(shù)組相比，殘余組織面積減少(P＜0.05)。與模型組比較，治療組脊髓組織的壞死程度及空洞范圍相對(duì)較小，伴有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，脊髓組織殘余面積增加(P＜0.05)。見(jiàn)表1、圖1。

圖1 各組術(shù)后7 d脊髓組織HE染色

表1 各組脊髓組織殘余面積比較(%)

2.2 TUNEL熒光染色

假手術(shù)組綠色熒光強(qiáng)度極弱。與假手術(shù)組比較，模型組TUNEL 染色陽(yáng)性率增加(P＜0.05)；與模型組比較，治療組TUNEL 染色陽(yáng)性率減少(P＜0.05)。見(jiàn)表2、圖2。

圖2 各組術(shù)后7 d脊髓組織TUNEL染色(×400)

表2 各組脊髓組織TUNEL染色細(xì)胞陽(yáng)性率比較(%)

2.3 ELISA

與假手術(shù)組比較，模型組IL-1β 和IL-18 含量增加(P＜0.05)；與模型組比較，治療組IL-1β和IL-18含量減少(P＜0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組血清中IL-1β、IL-18含量比較(μg/ml)

2.4 Western blotting

與假手術(shù)組比較，模型組NLRP3、Caspase-1 和GSDMD 蛋白水平增加(P＜0.05)；與模型組比較，治療組NLRP3、Caspase-1 和GSDMD 蛋白水平降低(P＜0.05)。見(jiàn)圖3、表4。

表4 各組焦亡蛋白的相對(duì)含量(/GAPDH)

圖3 各組術(shù)后7 d脊髓組織三種焦亡蛋白的表達(dá)(Western blotting)

3 討論

脊髓損傷的病理過(guò)程通常可分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷兩個(gè)階段[18]。原發(fā)性損傷是創(chuàng)傷暴力實(shí)施的瞬間直接對(duì)組織產(chǎn)生的破壞，導(dǎo)致血管破裂、軸突斷裂和神經(jīng)細(xì)胞死亡等，是一不可逆過(guò)程[19]。繼發(fā)性損傷以原發(fā)性損傷為基礎(chǔ)，是在其后即刻誘導(dǎo)發(fā)生的一系列細(xì)胞和分子的生物學(xué)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，可在受創(chuàng)最初的數(shù)分鐘內(nèi)發(fā)生，根據(jù)病理進(jìn)程分為急性期(數(shù)分鐘～14 d)、中期(14 d～6 個(gè)月)和慢性期(＞6 個(gè)月)[20]。在急性期內(nèi)，受損細(xì)胞釋放胞內(nèi)離子、活性蛋白及細(xì)胞因子等引發(fā)氧化應(yīng)激、興奮性中毒、炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)等，加速受損部位神經(jīng)細(xì)胞死亡[21]。細(xì)胞死亡的形式有多種，常見(jiàn)有自噬、凋亡、壞死和焦亡等，但哪個(gè)起主導(dǎo)作用尚未明確[22]。目前研究表明焦亡在細(xì)胞死亡中可能有較重要的作用[21,23]。在脊髓損傷中主要表現(xiàn)在繼發(fā)性損傷階段，此過(guò)程中產(chǎn)生觸發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)的損傷有關(guān)分子模式(damage-associated molecular patterns,DAMP)，可由胞膜上特異性識(shí)別這些模式的受體(pattern recognition receptors,PRRs)所識(shí)別，如NLRP3 炎性小體的C 端結(jié)構(gòu)域具有重復(fù)的賴氨酸序列即為DAMP的識(shí)別位點(diǎn)，一經(jīng)結(jié)合活化，可觸發(fā)下游以Caspase-1為主導(dǎo)的細(xì)胞焦亡產(chǎn)生。

細(xì)胞焦亡為近年來(lái)提出的一種新型細(xì)胞程序性死亡的方式，直觀表現(xiàn)為DNA 片段化，核固縮，細(xì)胞器變形解體，胞膜穿孔，細(xì)胞不斷脹大直至細(xì)胞膜破裂，導(dǎo)致胞內(nèi)的內(nèi)容物釋放進(jìn)而引起強(qiáng)烈的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。該概念于2001 年由Cookson 等[24]首次定義提出。細(xì)胞焦亡的發(fā)生發(fā)展需要依賴Caspase 的參與，主要分為兩個(gè)途徑：依賴Caspase-1 的經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑和Caspase-4/5/11介導(dǎo)的非經(jīng)典途徑[25]。在經(jīng)典途徑中，各種內(nèi)源或外源性因素刺激細(xì)胞產(chǎn)生DAMP或病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMP)，導(dǎo)致胞漿中的PRRs，如核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體(NOD-like receptors,NLRs)被激活。其中NLRP3 作為典型的NOD 樣受體，激活后可通過(guò)其特定結(jié)構(gòu)域與募集的細(xì)胞凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein,ASC) 和Caspase-1 前體分子結(jié)合，組裝為炎性小體，進(jìn)一步使得Caspase-1前體活化[26-27]。在胞內(nèi)活化的Caspase-1分子一方面能夠裂解IL-1β 和IL-18 前體使其加工成熟為具有活性的分子，另一方面能將GSDMD 切割為N 末端和C 末端兩個(gè)結(jié)構(gòu)域(N/C-terminal domain of GSDMD,GSDMD-NT/GSDMD-CT)。有活性的GSDMD-NT 通過(guò)與磷脂分子結(jié)合從而錨定在細(xì)胞膜上，在膜上形成10～15 nm 的小孔，具有活性的炎癥因子如IL-18、IL-1β等通過(guò)膜孔釋放，水分子通過(guò)膜孔進(jìn)入，細(xì)胞腫脹破裂，最終發(fā)生焦亡[28-29]。在焦亡過(guò)程中釋放的細(xì)胞促炎因子IL-1β、IL-18，能誘導(dǎo)炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)以及激活NF-κB 炎癥通路，會(huì)加重繼發(fā)性炎癥反應(yīng)，引發(fā)大量神經(jīng)細(xì)胞死亡[14]，對(duì)脊髓組織的病理結(jié)構(gòu)產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p害。

細(xì)胞焦亡與癌癥[30]、自身免疫性疾病[31]、神經(jīng)系統(tǒng)疾病[32-33]等的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。NLRP3 作為細(xì)胞焦亡的重要分子，在脊髓損傷后可被活性氧、組織蛋白酶等神經(jīng)毒性分子激活[34-35]。在有關(guān)大鼠脊髓損傷的研究中發(fā)現(xiàn)[36]，小膠質(zhì)細(xì)胞可表達(dá)大量NLRP3炎性小體。Dai 等[37]發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素可作用于NLRP3/Caspase-1 通路抑制神經(jīng)細(xì)胞焦亡，利于脊髓損傷大鼠的后肢運(yùn)動(dòng)功能改善和恢復(fù)，并減少脊髓組織的空洞面積和神經(jīng)細(xì)胞丟失。這些研究說(shuō)明NLRP3 相關(guān)通路在脊髓損傷后的細(xì)胞焦亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用。前期有關(guān)大鼠脊髓損傷研究中，蜘蛛香環(huán)烯醚萜類灌胃治療3 d可激活Nrf2/ARE通路減輕脊髓損傷氧化應(yīng)激反應(yīng)，一定程度上降低體內(nèi)活性氧含量[38]，提示蜘蛛香環(huán)烯醚萜類藥物可能通過(guò)減輕脊髓損傷后活性氧的過(guò)量累積對(duì)炎性小體NLRP3 的激活作用，在一定程度上抑制細(xì)胞焦亡。

目前，蜘蛛香環(huán)烯醚萜類成分已被證實(shí)在脊髓損傷中能發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[12-13]，涉及相關(guān)機(jī)制的研究較少，僅發(fā)現(xiàn)可能與調(diào)控Nrf2/ARE 通路減輕氧化應(yīng)激有關(guān)[38]，更多機(jī)制仍待進(jìn)一步探討。本研究從細(xì)胞焦亡的角度出發(fā)，證實(shí)蜘蛛香環(huán)烯醚萜類成分可抑制脊髓損傷后細(xì)胞焦亡，減輕炎癥，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，且與NLRP3/Caspase-1 這一經(jīng)典細(xì)胞焦亡通路的調(diào)控相關(guān)，但具體的調(diào)控方式、抑制神經(jīng)細(xì)胞焦亡的類型以及該藥物影響焦亡的途徑是否主要依賴此通路還需進(jìn)一步研究。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。