與蒙古冰草抗旱相關的NAC轉錄因子生物信息學及其表達分析

范菠菠， 張學峰， 于 卓， 趙 彥， 馬艷紅*

(1. 內蒙古農業大學農學院， 內蒙古 呼和浩特 010019； 2. 內蒙古農業大學草原與資源環境學院， 內蒙古 呼和浩特 010018)

轉錄因子(Transcription Factors，TF)在植物抗非生物逆境中起關鍵作用，主要的TF家族有WKRY，bZIP，MYB，BHLH，NAC等[1-2]。其中NAC家族是植物特有的、最大的TF家族之一，具有獨特的結構特征，其NAM結構域由N端150個左右的氨基酸殘基組成，含有5個亞結構域A—E[3-5]，其中A，C，D子域具有高度保守性，B，E子域有較大可變性，使NAC轉錄因子表現出多種調節功能。首個NAC基因在矮牽牛(PetuniahybridaVilm)中被發現[6]，隨后在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中發現了ATAF1/2和CUC2基因[7]，之后NAC基因在許多其他物種中被檢測到。目前，植物轉錄因子數據庫PlantTFDB(2021年3月17日)中收錄了19 997個NAC轉錄因子，其中擬南芥138個、粳稻(Oryzasativasubsp.japonica)170個、秈稻(Oryzasativasubsp.indica)158個、小麥(Triticumaestivum)263個、大豆(Glycinemax)269個，NAC轉錄因子廣泛參與植物的生長發育、逆境脅迫響應[8-13]。在干旱脅迫處理葡萄(Vitisvinifera)砧木后，qRT-PCR分析表明VvNAC8，VvNAC17，VvNAC18，VvNAC26，VvNAC40，VvNAC8，VvNAC56共7個基因與抗旱相關[12]。對甘薯(IpomoeabatatasLam.)的IbNAC72基因研究發現，干旱處理的轉基因煙草根系會更加發達[14]。在干旱環境中水稻SNAC1基因的表達可提高22%～34%的結實率[8]。水稻ONAC066在干旱中起正向調控作用[15]。小黑麥(TriticosecaleWittmack)的TwNAC01基因在抗旱應激反應中起重要作用[16]。擬南芥的ANAC069[17]、水稻的ONAC095在干旱脅迫中起負調控作用[18]。水稻的OsNAC006[19]，OsNAC14[20],大豆的GmNAC8[21]，GmNAC019[22]，GmNAC109[23]基因都對干旱脅迫有調控作用。

目前，影響植物生長發育的非生物逆境因素中干旱占首位，是造成作物產量大幅下降的主要逆境因素[24]。蒙古冰草(AgropyronmongolicumKeng)是耐旱性強的二倍體禾本科多年生牧草，具有作物遺傳改良的優異抗旱基因資源[25-26]。NAC轉錄因子在作物干旱逆境脅迫響應中發揮重要作用，但蒙古冰草抗旱相關的NAC轉錄因子的研究尚屬空白。本研究基于轉錄組數據，對蒙古冰草NAC轉錄因子家族成員進行鑒定，通過對NAC蛋白質結構域、理化性質、亞細胞定位、磷酸化位點、保守基序等進行分析，并與已報道具有抗旱功能的NAC蛋白進行多序列對比、構建系統進化樹，以期為蒙古冰草抗旱NAC轉錄因子鑒定及作用機制研究奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理

本試驗材料為蒙古冰草，種子采自于內蒙古農業大學薩拉齊牧草繁種基地。挑選顆粒飽滿的種子于室內培養箱(BIC-300)水培生長，培養溫度為24℃，光周期為16 h，在三葉一心時期用含25% PEG-6000的1/5 Hoagland’s營養液進行模擬干旱處理，每天定期補充蒸發水分，將未干旱處理的蒙古冰草葉片設置為對照(CK)。干旱處理12 h，24 h，48 h，3 d，5 d，7 d及復水24 h(fs24 h)的蒙古冰草葉片作為處理組，在每個處理時間取蒙古冰草葉片將其迅速放入預冷的無酶凍存管中，迅速轉移到—80℃冰箱進行保存；每個處理時期3次重復，提取蒙古冰草葉片總RNA，委托杭州聯川生物技術股份有限公司進行轉錄組測序。

1.2 蒙古冰草NAC轉錄因子篩選及結構域鑒定

基于蒙古冰草轉錄組測序結果，根據功能注釋初步篩選出37個NAC轉錄因子，用ORF Finder在線軟件(https://www.ncbi. nlm.nih.gov/orffinder)對基因的開放閱讀框(Open Reading Frame，ORF)進行選擇，并進行結構域比對，然后再用Pfam(http://pfam.xfam.org/)，CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)軟件進行預測驗證。

1.3 蒙古冰草NAC蛋白的理化性質及亞細胞定位預測

通過Protparam(https://web.expasy.org/protparam/)[27-28]對NAC蛋白的理化性質[Isoelectric Point(PI)值，蛋白相對分子質量，不穩定指數，脂肪系數，親疏水性以及氨基酸數目]進行分析；利用Softberry(http://linux1.softberry.com/)對NAC蛋白的亞細胞定位進行預測。

1.4 蒙古冰草NAC蛋白磷酸化位點分析

應用NetPhos 3.1 server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)[29]對蒙古冰草15個NAC蛋白序列中磷酸化位點進行預測。

1.5 蒙古冰草NAC蛋白系統發育樹構建

將蒙古冰草15條具有完整結構域的NAC蛋白，與從Uniprot(https://www.uniprot.org/)及NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數據庫挑選的57條擬南芥和具有抗旱功能的13條玉米、水稻、小麥和大豆等作物的NAC蛋白進行進化關系分析，用MEGA 7.0[30]的Muscle進行多序列比對，并基于相鄰連接法(neighbor-joining)構建系統進化樹，應用ITOL(https://itol.embl.de/)軟件進行美化。

1.6 蒙古冰草NAC蛋白的保守基序及序列比對

利用MEME(https://meme-suite.org/meme/)軟件對蒙古冰草AmNAC102-2，AmNAC100及高度同源的小麥、水稻和小黑麥的NAC蛋白進行保守基序分析，并通過DNAMAN6.0對這5條蛋白進行多序列比對。

1.7 蒙古冰草NAC蛋白二、三級結構預測

通過SOPMA[31](https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page= npsa_sopma. html)在線軟件對NAC蛋白二級結構預測，分析其中的螺旋、轉角、延伸鏈及無規則卷曲所占比例，用SWISS-MODEL[32](https://swissmodel.expasy.org/)對其進行三級結構預測。

1.8 蒙古冰草抗旱NAC基因的qRT-PCR

用SnapGene 3.2.1對篩選出的蒙古冰草抗旱相關的AmNAC100和AmNAC102-2基因的特異性引物進行設計，以U6作為內參基因(引物序列見表1)，并委托生工(Sangon，上海)合成。

表1 蒙古冰草抗旱相關NAC基因qRT-PCR引物序列Table 1 The sequence of qRT-PCR primers of drought resistance related NAC gene of A. mongolicum Keng

用FastQuant RT Kit(with gDNase)試劑盒(KR106)將蒙古冰草處理組及對照組的Total RNA反轉錄為cDNA，用MonAmp SYBR Green qPCR Mix試劑盒(MQ10201S)進行qRT-PCR試驗，每個處理4次生物學重復。反應體系為MonAmp SYBR Green qPCR Mix試劑10 μL，cDNA模板1 μL，上下游引物(10 μM)各0.5 μL，Nuclease-Free Water 8 μL。反應程序為預變性95℃，30 s，變性95℃，10 s，退火延伸62℃，30 s，循環數為45，在FTC-3000P上運行程序。

用livak等的2-ΔΔCT法[34]計算蒙古冰草2個NAC基因的相對表達量，用SPSS 26.0軟件進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 蒙古冰草NAC轉錄因子家族的鑒定分析

從轉錄組數據庫挑選出注釋為NAC轉錄因子的37個基因，通過ORF分析和結構域預測，獲得具有NAC蛋白結構域的26個基因，其中11條NAM結構域存在殘缺現象，14條NAC蛋白的NAM結構域在150個氨基酸殘基左右，為完整的NAM結構域；只有一條AmNACA2蛋白預測為完整的NAC-NACA結構域(圖1)。

2.2 蒙古冰草NAC蛋白理化性質和亞細胞定位分析

通過Protparam對26個NAC蛋白進行理化性質分析，發現NAC蛋白氨基酸數目在60～432之間，相對分子量在7 080.09～47 615.03之間；PI值為4.24～10.48，表明既有酸性蛋白也有堿性蛋白；不穩定指數在31.92～71.92之間，脂肪系數介于57.10～77.83，NAC蛋白的疏水性為—0.780～-0.257，表明所有蒙古冰草NAC蛋白均為親水性蛋白(表2)。

通過Softberry軟件進行亞細胞定位分析，發現AmNACA2,AmNAC1-2蛋白定位在線粒體，AmNAC046定位于細胞質，其余蛋白均定位于細胞核，說明NAC蛋白主要在細胞核中行使功能，也有少數在其他細胞器中發揮作用。

2.3 蒙古冰草NAC蛋白磷酸化位點分析

蛋白磷酸化是植物中普遍存在的一類現象，出現在植物蛋白激酶及信號轉導過程中，屬于蛋白翻譯后修飾中的一種[31-32]。對蒙古冰草的15個NAC蛋白進行磷酸化位點分析，發現其均含有絲氨酸、蘇氨酸以及酪氨酸，其中磷酸化位點總數最多的是AmNAC103蛋白(41個)，最少的是AmNAC036-4蛋白(8個)。

圖1 蒙古冰草NAC家族序列結構域Fig.1 Sequence domain of A. mongolicum Keng NAC family

表2 蒙古冰草NAC蛋白理化性質及亞細胞定位Table 2 Subcellular localization and physicochemical properties of NAC protein of A. mongolicum Keng

表3 蒙古冰草NAC蛋白磷酸化位點預測Table 3 The predicted phosphorylation sites of NAC proteins from A. mongolicum Keng

2.4 蒙古冰草NAC蛋白進化關系分析

為研究蒙古冰草NAC蛋白家族的進化關系，繪制系統進化樹，蛋白名標簽分為6種顏色，將進化樹分為Ⅰ～Ⅵ亞族。進化樹枝的顏色從綠色到紅色過渡，代表同源性從0到1。縱觀整個進化樹，除Ⅳ和Ⅴ亞族不含蒙古冰草NAC蛋白外，其余亞族中均有分布，說明Ⅳ和Ⅴ中的擬南芥蛋白與蒙古冰草NAC蛋白無進化關系。AmNACA2蛋白單獨成一個分支，AmNAC073處于Ⅱ亞族與擬南芥AtNAC73,AtNAC10等在一個小支上。有7個蒙古冰草NAC蛋白處于第Ⅲ亞族，分別為AmNAC103，AmNAC071，AmNAC090-1，AmNAC090-2，AmNAC042，AmNAC036-1和AmNAC036-4。其余蒙古冰草蛋白都處于第Ⅵ亞族，其中AmNAC2-1與擬南芥AtNAC50在同一支上；AmNAC100與小黑麥的抗旱蛋白TwNAC01[16]同源性極高；AmNAC041與擬南芥AtNAC83處于同一分支；AmNAC2-2，AmNAC047-1與AtNAC47有較近進化關系；AmNAC102-2蛋白與抗旱功能已知的小麥TaNAC6[34]和水稻OSNAC6[35]，OsNAC5[36]同源性較高。由此推測AmNAC100和AmNAC102-2參與干旱脅迫調控。

2.5 蒙古冰草抗旱相關的NAC蛋白二、三級結構分析

對AmNAC100和AmNAC102-2進行蛋白結構預測分析，結果表明AmNAC100蛋白二級結構中無規則卷曲占51.26%，α-螺旋占25.49%，延伸與β-轉角分別占16.25%，7.00%；AmNAC102-2蛋白中無規則卷曲占58.62%，α-螺旋占13.10%，延伸與β-轉角分別占20.69%，7.59%；TaNAC6中無規則卷曲占67.11%，α-螺旋占18.12%，延伸和β-轉角分別占11.07%，3.69%；水稻OsNAC5中無規則卷曲占60.49%，α-螺旋占22.19%，延伸和β-轉角分別占12.46%和4.86%；小黑麥中TwNAC01無規則卷曲占53.98%，α-螺旋占22.73%，延伸和β-轉角分別占16.48%，6.82%(圖3)。由以上數據可知，蒙古冰草的2個抗旱相關NAC蛋白的二級結構主要以無規則卷曲為主，其次含α-螺旋、延伸和轉角。

NAC蛋白三級結構分析結果發現AmNAC100與TwNAC01空間構型一致；AmNAC102-2與TaNAC6，OsNAC5蛋白空間構型保持一致(圖4)，與蛋白進化樹中同源關系相一致。

圖3 NAC蛋白二級結構Fig.3 Secondary structure of NAC protein注：藍色，α-螺旋；紫色，無規則卷曲；紅色，延伸；綠色，β-轉角Note:Bue,alpha-helix;purple,random coil;red,extended strand;green,beta turn

圖4 NAC蛋白三級結構Fig.4 Tertiary structure of NAC protein

2.6 蒙古冰草抗旱相關NAC蛋白基序及保守結構域分析

保守基序分析發現，5個NAC蛋白輸出的有效motif有8個，均含有motif 1，2，3和8(圖5)，說明這4個motif是蒙古冰草AmNAC100和AmNAC102-2蛋白的共有基序。AmNAC102-2蛋白不含motif4，其motif 1，2，3和8與TaNAC6，OsNAC5一致；AmNAC100與TwNAC01都含有motif5，6，7，這兩個蛋白基序結構一致。

將蒙古冰草AmNAC100，AmNAC102-2與小麥、水稻和小黑麥的已知抗旱功能NAC蛋白進行多序列比對發現，其保守結構域均分為A—E亞結構域，其中D，E亞結構域是重要的DNA結合區域，A亞結構域在NAC二聚體蛋白形成中發揮作用。

圖5 抗旱相關NAC蛋白基序Fig.5 The motif of NAC protein related to drought resistance

圖6 保守結構域的多序列比對Fig.6 Multiple sequence alignment of conserved domains

2.7 蒙古冰草2個抗旱相關的NAC基因的表達分析

蒙古冰草抗旱相關的AmNAC100和AmNAC102-2在25% PEG-6000處理期間表達量均高于CK。其中AmNAC100基因干旱處理12 h，3 d以及復水24 h的相對表達量分別是CK的15.37，18.70和14.65倍(P<0.05)，只有干旱處理24 h后AmNAC100基因相對表達量與CK差異不顯著；AmNAC102-2基因相對表達量較高的處理組有12 h，48 h，3 d及復水24 h，分別是CK的7.34，3.67，4.04以及7.12倍(P<0.05)(圖7)，表明蒙古冰草的2個NAC基因在25% PEG-6000 模擬干旱處理中均可被誘導表達。

圖7 25% PEG-6000 干旱脅迫下蒙古冰草抗旱相關的NAC基因相對表達量Fig.7 Relative expression of drought resistance related NAC genes in Agropyron mongolicum Keng under 25% PEG-6000 drought stress注：不同小寫字母表明差異顯著(P<0.05)Note:Different lowercase letters indicate significant difference at the 0.05 level

3 討論

為篩選與蒙古冰草抗旱相關的NAC轉錄因子，本研究基于轉錄組測序數據篩選出26個蒙古冰草NAC家族成員，其中15個具有完整NAC轉錄因子結構域。生物信息學分析發現蒙古冰草NAC轉錄因子均屬于親水性蛋白，與大豆、苦蕎、蘋果等[32,37-38]對NAC蛋白親疏水性的研究結果一致。亞細胞定位發現蒙古冰草NAC蛋白主要定位于細胞核中，有2個定位于線粒體中、1個在細胞質中，說明大部分蛋白在細胞核中發揮作用，少數在其他細胞器中行使功能。

大量研究表明NAC蛋白在非生物脅迫中起正調控作用，比如IbNAC72[14]，SNAC1[8]，ONAC066[15]等。將15個NAC蛋白與擬南芥和已知抗旱功能的13個NAC蛋白構建系統進化樹，預測到2個抗旱相關的NAC轉錄因子，其余蒙古冰草NAC蛋白分布于Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ和Ⅵ亞族中。處于同亞族的蒙古冰草NAC基因與其他物種的NAC基因同源性存在差異，推測是由環境和物種間差異引起的，這與周棋贏、黃文娟和榮玉萍的研究一致[5,37,39]。磷酸化位點預測結果與方志紅研究結果一致，均含有絲氨酸、蘇氨酸及酪氨酸磷酸化位點[32]。二、三級結構預測發現蒙古冰草AmNAC100與TwNAC01結構相似，AmNAC102-2與TaNAC6，OsNAC5相似，推測其有相同的抗旱功能。

保守結構域承載著基因的重要遺傳信息，對其發揮特定調控功能具有重要意義[5,40]，擁有相同的保守結構域可能發揮相似的功能。根據Hisako等人對NAC蛋白保守結構域的劃分，將5個抗旱相關NAC蛋白的保守結構域分為A—E亞結構域[41]，通過顏色來區分NAC蛋白序列的保守關系，黑色區域表示序列相似性在100%即完全相同，粉紫色代表相似性≥75%，淺藍色表示相似性在50%及以上，黃色表示相似性在33%以上，無色代表相似性在0～33%。通過著色可以清晰的看到保守性從高到低依次為A>C>D>B>E，高保守性結構域用來維持NAC基因特定功能，有研究表明保守的NAC結構域承擔DNA結合的功能[41]；子域B和E的保守性相對較小，是可變動的結構域，推測其可用來激活調控植物其他功能[41]。

王婉妮對干旱脅迫下3種葡萄砧木進行實時熒光定量分析發現，NAC基因相對表達量均高于對照[12]；張歡等對甘薯抗旱基因IbNAC72的qRT-PCR發現，其在20% PEG-6000處理中相對表達量均高于對照，起正調控作用[14]，這與本研究結果相似。本試驗中qRT-PCR分析表明，經過生物信息學篩選得到蒙古冰草2個抗旱相關的AmNAC100和AmNAC102-2基因，在25% PEG-6000干旱處理下其相對表達量上升，呈上調表達。

4 結論

本研究首次從蒙古冰草轉錄組測序結果中篩選鑒定出26個NAC轉錄因子，得到15個有完整結構域的NAC蛋白，通過進化關系比對及保守基序,保守結構域和NAC蛋白二、三級結構分析，獲得2個抗旱相關的AmNAC100和AmNAC102-2基因，對其進行差異表達分析發現其在干旱脅迫中起正調控作用。