對啶酰菌胺敏感性不同的幣斑病菌致病性分析

趙正陽， 索 欣， 陳 玲， 劉雄洲， 胡 健， 尹淑霞*

(1.北京林業大學草業與草原學院， 北京 100083； 2.南京農業大學草業學院， 江蘇 南京 210095)

匍匐翦股穎(Agrostisstolonifera)為禾本科(Poaceae)翦股穎屬(Agrostis) 多年生冷季型草坪草，具有較強的耐寒性、耐陰性，極耐低修剪，坪觀質量好，被廣泛用作冷涼地帶高爾夫球場果嶺草坪等運動場建植[1-3]。

幣斑病是匍匐翦股穎草坪的重要病害之一，該病由幣斑病菌為害引致[4-5]。最新的研究[6-7]將幣斑病菌歸在Clarireedia屬，分為Clarireediahomoeocarpa，Clarireediabennettii，Clarireediajacksonii，Clarireediamonteithiana和Clarireediapaspali5個種。研究表明，草坪修剪高度過低、修剪頻率過高都會加速該病原菌的侵染[8]。幣斑病發生后，如不及時處理將會嚴重影響草坪的觀賞和使用價值。

當前翦股穎幣斑病主要依靠化學防治，而頻繁施用化學藥劑易使幣斑病菌產生抗藥性[9-10]。國內外關于草坪幣斑病菌抗藥風險的研究多集中在病原菌自身的抗性頻率與對不同藥劑的交互抗性等方面，例如通過田間采集抗藥性菌株，室內對其進行殺菌劑的敏感性測定，或者運用分子生物學方法揭示抗藥性機理[11]。植物病原菌對殺菌劑的抗性風險由病原菌自身與藥劑共同決定[12-13]。啶酰菌胺通過抑制琥珀酸脫氫酶的活性，抑制病原菌孢子萌發與菌絲生長，不易與其他類型殺菌劑產生交互抗性，國外早在2004年便使用啶酰菌胺對草坪幣斑病進行有效防治[14-15]。但該殺菌劑在國內草坪管理中尚未廣泛應用，目前不僅缺乏病原菌對啶酰菌胺的抗性風險評價研究，而且對于病原菌對啶酰菌胺敏感性降低后其致病性是否會變化亦沒有明確結論。本研究旨在通過對啶酰菌胺不同敏感性的幣斑病菌致病性等特性進行研究，為啶酰菌胺的抗藥性風險評定奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

采自天津3家高爾夫球場(龍海高爾夫俱樂部，濱海湖高爾夫俱樂部和濱海森林高爾夫俱樂部)的幣斑病菌菌株106株，98%啶酰菌胺(boscalid)原藥購自湖北薪和化工有限公司，匍匐翦股穎品種‘克羅米’(‘Kromi’)的種子來自本實驗室。

1.2 試驗方法

1.2.1幣斑病菌對啶酰菌胺的敏感性測定 參照聶秀美[16]的方法對采自天津的幣斑病菌分離、純化。采用基礎培養基(MM)[17]測定幣斑病菌對啶酰菌胺的敏感性。將啶酰菌胺原藥用丙酮配置成終濃度為質量濃度1，10，100，1 000 μg·mL-1的含藥平板。將菌株在MM培養基上,25℃黑暗條件培養3 d后，在邊緣打取5 mm菌餅，接種至各濃度藥板上，每濃度重復3次，同時在空白對照中加入等體積的丙酮。于25℃恒溫培養箱中培養3 d，采用十字交叉法測量各處理菌落直徑計算菌絲生長抑制率，求出毒力回歸方程和抑制中濃度(EC50/μg·mL-1)。以Chang[18]報道的幣斑病菌對啶酰菌胺的敏感基線4.67 μg·mL-1為參照，計算菌株的抗性水平，對抗性進行分級。

敏感菌株(SS)：R<10，低抗菌株(LR):10≤R≤50，高抗菌株(HR)：R≥100[19]。

1.2.2菌落形態與同源性比對分析 從每種抗性菌株中隨機挑選2株，分別命名為高抗株(HR1，HR2)，低抗株(LR1，LR2)和敏感株(SS1,SS2)。6株菌株置于25℃恒溫黑暗培養14 d，觀察菌落形態并拍照。

參考章武[5]的方法，合成rDNA-ITS區通用引物ITS-1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS-4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)(北京科百奧生物技術有限公司合成)，以6個幣斑病菌菌株的基因為模板進行PCR擴增，將PCR產物委托睿博興科(北京)有限公司進行DNA測序。將測序返回的基因序列與Gen-Bank核酸數據庫進行比對，并用MEGA 7.0進行系統發育分析和進化樹構建，用Neighbor-joining法構建進化樹，自展次數為1 000次。

1.2.3病菌生長速率和生物量測定 將菌株活化后，用直徑6 mm的打孔器打取菌餅，菌面朝上，分別放置在普通馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基和表面鋪有滅菌玻璃紙的PDA培養基上，每個菌株接種3皿，于25℃恒溫恒濕培養箱中黑暗培養3 d，采用十字交叉法測定菌落直徑，單位為mm，計算病菌生長速率；將長有菌絲的玻璃紙取出，刮下表面菌絲并稱重[20]。每皿重復3次。

1.2.4病菌草酸產量測定 菌株活化后，分別取3枚菌餅放置在25 mL錐形瓶中，瓶中加入15 mL無菌馬鈴薯葡萄糖培養液，于25℃，180 rpm搖床上培養3 d，培養好的菌液濾去菌絲后，10 000 r·min-1離心濾液10 min，吸取1.8 mL上清液，采用比色法測定草酸產量[21]。每個菌株接種3瓶，每瓶取3次菌液進行草酸含量測定。

1.2.5匍匐翦股穎發病率及病情指數測定 在蔡文涌[22]方法的基礎上略有改動。在匍匐翦股穎播種45 d后，選取生長一致的盆栽匍匐翦股穎，分別接種6個菌株，每個菌株用打孔器選取4枚直徑為6 mm的菌餅，均勻放置于匍匐翦股穎葉片上，對照組放置6 mm空白PDA培養基塊。每個處理設3組重復，共21盆。接菌前按三分之一原則修剪匍匐剪股穎，接菌后用去離子水噴濕葉片，并套袋保濕。接種后96 h統計發病率，并計算病情指數[23]。

病情指數=

1.2.6匍匐翦股穎葉片丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量測定 MDA含量測定參考王軍的方法[24]。分別于匍匐翦股穎接菌前0 h，接菌后6 h，12 h，24 h，48 h和96 h取樣，進行匍匐翦股穎葉片丙二醛測定，在對照組(CK)的處理中，用6 mm空白PDA培養基塊代替試驗組中的菌餅。每盆取葉片0.10～0.15 g，每次取樣范圍涵蓋盆內所有植株。

1.3 數據分析

采用SPSS 18.0軟件對所測數據統計分析，采用描述統計模塊進行Shapiro-Wilk法(W法)正態性檢驗，用t檢驗對數據進行差異顯著性分析，采用Excel 2016制圖。

2 結果與分析

2.1 幣斑病菌對啶酰菌胺的敏感性

106株幣斑病菌株對啶酰菌胺的敏感性結果如圖1所示。結果表明，天津地區草坪幣斑病菌對啶酰菌胺的敏感性差異較大，106株菌株中，EC50最小值為1.45 μg·mL-1，最大值為637.54 μg·mL-1。經W法正態性檢驗，106株菌株EC50值頻次分布，W=0.35，P<0.001，呈非連續性分布。其中，93株敏感菌株的EC50值介于1.45～9.24 μg·mL-1之間(表1)，呈連續性正態分布，W=0.98，P=0.27>0.05(圖2)；11株低抗菌株的EC50值介于53.64～89.57 μg·mL-1之間(表1)；2株高抗菌株的EC50值分別為496.87 μg·mL-1，637.54 μg·mL-1(表1)，抗性菌株的EC50值呈非連續性分布(圖1)。

2.2 菌落形態

6株菌株培養14 d的菌落形態如圖3所示。HR1，HR2號菌株菌絲稀疏，菌絲為白色絮狀，少見有直立向上的氣生菌絲，菌絲多為匍匐生長。LR1，LR2號菌株氣生菌絲較為發達，菌絲密度高，部分菌絲附著在培養皿上蓋，菌落邊緣有部分菌絲聚集。SS1，SS2號菌株菌絲致密，能明顯看到菌絲積聚成團，成團后菌絲塌陷，部分菌落表面由白色變為淡褐色。

圖1 106株供試菌株菌絲生長EC50值頻率分布Fig.1 Frequency distribution of EC50 values for the mycelial growth of 106 strains of Clarireedia

圖2 對啶酰菌胺敏感的93株菌株菌絲生長EC50值頻率分布Fig.2 Frequency distribution of EC50 values for the mycelial growth of 93 sensitive strains of Clarireedia

2.3 菌株同源性比對分析

利用NCBI網站中的BLAST軟件，對所測菌株的序列進行同源性比對并構建系統發育樹(圖4)。6個菌株與幣斑病病原菌的同源性均達到97%以上。從構建的系統發育樹可以看出，本研究中的6株幣斑病原菌和Clarireedia屬的幣斑病菌聚在同一分類單元，但6個菌株分別屬于兩個種，其中HR2和LR1號菌株為C.monteithiana，其余菌株為C.jacksonii種。

表1 幣斑病菌對啶酰菌胺的敏感性Table 1 Sensitivity of Clarireedia to boscalid

圖3 不同菌株在PDA上25℃黑暗條件下培養14 d的菌落形態Fig.3 Cultural characteristics of different strains on PDA at 25℃ in dark(14 d)

2.4 菌株生長速率、菌絲生物量和草酸產量

不同菌株的生長速率、菌絲生物量和草酸產量如表2所示。

從菌株生長速率看，菌株HR1生長最慢，與其他5個菌株差異顯著(P<0.05)。菌株SS2生長最快，是HR1的1.52倍，是HR2的1.27倍，差異顯著(P<0.05)。同為高抗菌株的HR1和HR2，其生長速率差異顯著，但LR1與LR2以及SS1與SS2的菌絲生長速率則無顯著差異。

從菌絲生物量上看，HR1菌株生物量最低，僅為低抗菌株的34.7%～35.8%，與其他菌株間差異顯著(P<0.05)。SS2菌株生物量最高，是HR1菌株的3.86倍，與其他5個菌株差異顯著(P<0.05)。HR1,HR2菌株生物量與SS1,SS2菌株的生物量差異顯著(P<0.05)。LR1和LR2菌株的生物量無顯著差異。

從草酸產量上看，HR1菌株草酸產量最低，為低抗、敏感菌株產量的52.3%～56.4%，與其他菌株草酸產量差異顯著(P<0.05)。SS2菌株草酸產量最高，敏感(SS1和SS2)與低抗菌株(LR1和LR2)間的草酸產量無明顯差異，高抗(HR1和HR2)與敏感菌株(SS1和SS2)間草酸產量差異顯著(P<0.05)。

2.5 匍匐翦股穎發病率及病情指數

匍匐翦股穎接種不同菌株后96 h的發病率及病情指數如表3所示。

從發病率來看，除LR1和LR2外，相同抗性菌株(HR1和HR2，SS1和SS2)處理的匍匐翦股穎之間發病率差異顯著(P<0.05)，其中接種了HR1和HR2菌株的匍匐翦股穎發病率(分別為6.88%和25.33%)最低，與接種低抗菌株植物體的發病率相比，降幅在37.5%以上，與低抗、敏感菌株差異顯著(P<0.05)。接種了SS1和SS2菌株的匍匐翦股穎發病率(分別為58.46%和66.84%)最高，是高抗菌株的2.3～9.7倍，與低抗、高抗菌株差異顯著(P<0.05)。

從病情指數來看，接種了HR1和HR2菌株的匍匐翦股穎病情指數最低，分別為低抗菌株的28.4%～64.5%，與低抗、敏感菌株差異顯著(P<0.05)。接種了SS1和SS2菌株的匍匐翦股穎病情指數最高，是HR1菌株的4.5倍和6.1倍，與低抗、高抗菌株差異顯著(P<0.05)；接種LR1和LR2菌株的翦股穎病情指數無顯著差異。6個菌株侵染匍匐翦股穎后的發病率與病情指數高低表現一致。

圖4 基于ITS-rDNA序列采用鄰接法(NJ)構建的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree constructed using Neighbor-Joining method based on ITS rDNA sequences

表2 不同菌株的生長速率、菌絲生物量和草酸產量Table 2 Growth rate,mycelial biomass and oxalic acid amount of different strains

表3 匍匐翦股穎接種不同菌株的發病情況Table 3 Incidence and disease index of creeping bentgrass inoculated with different strains

2.6 MDA含量變化

匍匐翦股穎接菌前與接菌后96 h內的葉片MDA含量變化如圖5所示。

圖5 6株幣斑病菌株接種后匍匐翦股穎葉片的MDA含量變化Fig.5 Changes of MDA content in creeping bentgrass leaves inoculated with 6 Clarireedia strains

由圖5可知，隨著時間的推移，與CK相比，接菌的匍匐翦股穎葉片MDA含量均顯著上升，且呈現出先上升，再下降，最后又上升的趨勢。在6 h時，接菌處理的植物葉片MDA含量均大幅增加，其中HR1號菌株處理的翦股穎葉片MDA含量僅為5.37 μmol·g-1，顯著低于低抗菌株與敏感菌株處理(P<0.05)；SS2號菌株處理的葉片MDA含量達到10.36 μmol·g-1，是HR1處理的1.9倍，與HR1，HR2差異顯著(P<0.05)，低抗菌株處理組與敏感菌株處理組無明顯差異。在6～12 h，植物葉片中MDA含量出現了不同程度的下降，隨后整體呈上升趨勢。不同處理的植株葉片MDA含量在96 h達最大值，其中HR1號菌株處理的翦股穎葉片MDA含量最低，僅為5.98 μmol·g-1；SS1號菌株處理的葉片MDA含量最高，是HR1號菌株處理的2.56倍，高抗與敏感菌株處理的植株葉片MDA含量差異顯著(P<0.05)。

3 討論

幣斑病是高爾夫球場草坪主要病害之一，近年來幣斑病菌抗藥性問題逐漸顯現，北京、海南、江蘇等地[17]均報道有幣斑菌株群體對殺菌劑的敏感性下降情況。本研究在天津幣斑病菌群體中發現13株對啶酰菌胺敏感性下降的菌株，表明天津地區的幣斑病菌抗藥性問題已經出現，在使用殺菌劑時應加以重視。6株菌株分別屬于C.monteithiana，C.jacksonii兩種，與胡健研究的我國幣斑病菌分類結果一致[7]。

本研究分析了對啶酰菌胺不同敏感性幣斑病菌的致病性，病原菌的致病力強弱體現在多個方面。鄧小軍[25]的研究表明，致病力強的菌株生長速率與生物量均高于致病力弱的菌株，強致病力菌株的菌絲較弱致病力菌株的菌絲更為致密。本研究中致病性強的SS菌株菌絲生長致密，生長快，生物量大。幣斑病菌產生的草酸毒素是其致病能力的決定因子之一[26]。Nacarath[27]的研究中發現一株不產草酸的菌株，幾乎沒有致病力，施加外源草酸后致病力恢復。也有研究表明，在一定范圍內，病菌對植株致病力強弱與草酸分泌量成正比[28-29]。本研究中HR菌株的草酸分泌量顯著低于SS菌株，尤其HR1菌株的草酸產量最低，其致病性也是6個菌株中最低的。李琨[30]的研究發現，與弱毒菌株相比，水稻白葉枯病菌強毒菌株能使水稻葉片MDA含量顯著增加。本研究也證實了這一點。由此可以說明，用單一指標來評價病原菌致病性存在片面性和不穩定性，用多個指標進行綜合評價可以更好地保證結果的可靠性。

病原菌對殺菌劑的敏感性下降后，往往會引起生物適合度的降低[15]。本研究結果也表明，啶酰菌胺敏感菌株，其致病力較強，總體表現為生長速率快、生物量高，草酸產量高，發病率、病情指數和植株葉片MDA含量等數據也表明致病力強的菌株侵染草坪草的能力更強。而對啶酰菌胺敏感性下降的菌株，其致病力也明顯降低。但也有研究表明，病原菌對殺菌劑的敏感性下降時，不會引起病原菌致病力的改變[31]，甚至對殺菌劑敏感性下降菌株的致病力等生物適合度出現了明顯增加[32]。由此可見，病原菌對藥劑敏感性變化對其致病力的不同影響，可能與菌株自身和藥劑種類有關，因此在研究啶酰菌胺的抗性風險時，有必要針對啶酰菌胺敏感性下降菌株分析其致病力變化情況。

4 結論

本研究發現天津幣斑病病原菌自然群體對啶酰菌胺的敏感性發生分化，部分菌株已產生抗藥性。其中啶酰菌胺對93株敏感病原菌EC50均值及頻率分布可以作為天津地區草坪幣斑病菌種群對啶酰菌胺抗性監測的參考之一。HR1菌株對啶酰菌胺的敏感性降低與自身弱致病力產生的原因可能與HR2不同，HR1菌株可能作為低毒菌株而具有對草坪幣斑病生防的潛力[33]。總體上，對啶酰菌胺高抗菌株的致病性最弱，敏感菌株的致病性最強，低抗菌株的致病性介于二者之間。研究結果為進一步探究幣斑病菌對啶酰菌胺的抗藥性風險奠定了基礎。