MicroRNA-326通過靶向Klk7調控MAPK信號通路對抑郁模型大鼠的神經保護作用

劉 濤，張 望，鐘艷麗*，吳宏偉

(1.重慶市精神衛生中心老年科，重慶 401147；2.第三軍醫大學基礎醫學院神經生物學教研室，重慶 400038)

重度抑郁癥(major depressive disorder，MDD)是一種具有多種癥狀的情緒障礙，對人類的健康及生存存在著重大威脅， 其病理生理學涉及多種機制，包括單胺缺乏、晝夜節律異常、下丘腦-垂體-腎上腺軸失調、激素狀態變化和炎性細胞因子水平升高[1]。 盡管現在市面上有多種抗抑郁藥，但仍有將近三分之一的患者難以被治愈[2]。 因此，有必要進一步了解抑郁癥的發病機制，發展更為有效的治療方法。成熟神經元細胞的減少和神經細胞凋亡的增加是參與抑郁癥生理和病理過程的兩個重要因素，抑制神經炎癥的發生和海馬神經元細胞凋亡可以改善抑郁樣行為[3]。miRNA屬于小的非編碼RNA(18-25 nt)，參與抑郁癥的發生發展過程[4]。另有研究表明，miR-326參與了細胞凋亡、腫瘤生長、細胞侵襲、胚胎發育、免疫調節、化療抵抗和腫瘤發生等生物學進程[5]。激肽釋放酶(Kallikreins，Klks)是15種絲氨酸蛋白酶的總稱，參與各種生理進程和疾病的進展[6]。已有研究證明KLK4-7的共表達，可激活MAPK信號通路，促進卵巢癌疾病進展[7]。生長素釋放肽通過抑制小鼠海馬神經元中的p38-MAPK信號通路活化而發揮抗抑郁作用[8]。綜上所述，本研究采用CUMS建立抑郁癥大鼠模型，探究miR-326靶向激肽釋放酶成員Klk7通過有絲分裂原激活的蛋白激酶( mitogen activated protein kinase，MAPK)信號通路對抑郁癥模型大鼠海馬神經元的影響，旨在為抑郁癥新療法的開發提供科學依據。報告如下。

1 材料與方法

1.1材料 胎牛血清、DMEM培養基購自Gibco公司；兔抗Klk7、p38、p-p38、JNK、p-JNK、ERK1/2、p-ERK1/2和GAPDH抗體，HRP標記二抗購自Abcam公司；高效RIPA裂解液、碘化丙啶(propidium Iodide,PI)購自Solarbio公司；BCA法蛋白質濃度測定試劑盒、ECL超敏化學發光試劑盒購自Sangon Biotech公司；miR-326 mimic、miR-326 inhibitor、陰性對照(negative control，NC)、siRNA-Klk7-1和siRNA-Klk7-2均由上海吉瑪制藥技術有限公司合成；TUNEL染色試劑盒購自全式金生物；CCK-8購自英格恩生物公司；大鼠海馬神經元細胞完全培養基購自上海一研生物科技有限公司。

1.2實驗動物及分組 體重為180～220 g的雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠共20只(第三軍醫大學醫學實驗動物中心)，動物房飼養，室內溫度(23±2)℃，保持通風換氣，普通鼠飼料喂養。待大鼠適應環境后，將其隨機分為2組：空白對照組、慢性不可預測輕度應激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)組，每組10只。

1.3抑郁癥大鼠模型的建立 本研究采用CUMS建立抑郁癥大鼠模型[9]。CUMS組大鼠每天隨機選擇以下一種刺激執行：禁食、禁水24 h；黑白顛倒12 h/12 h；高溫環境飼養；潮濕墊料飼養；噪音干擾；強迫游泳；行為束縛。連續2 d的刺激不能相同，持續刺激3周，每種刺激執行3次。空白對照組大鼠不進行刺激，正常飼養。

1.4大鼠行為學變化檢測

1.4.1蔗糖偏好實驗 造模結束后，提供各組大鼠1%蔗糖溶液。24 h后，對大鼠禁食、禁水12 h。給各組大鼠提供瓶裝自來水和1%蔗糖溶液12 h。6 h后，將2個瓶的位置對調，避免偏側。蔗糖偏愛(SP)值的計算公式如下所示：

1.4.2曠場實驗 實驗在一個開口的黑色木盒(長81 cm×寬81 cm×高28 cm)中進行，木盒底部被分成16個等大的方格。將大鼠放置在木盒底部中央，讓其自由探索6 min。待大鼠適應2 min后，記錄大鼠在4 min內穿越底部的方格數。

1.4.3強迫游泳實驗 準備直徑為15 cm的透明圓桶，桶內水深20 cm，水溫22～25 ℃。將大鼠置于水中15 min進行適應性訓練。24 h后，將大鼠置于水中，待大鼠適應2 min后，記錄大鼠在4 min內的靜止時間。

1.5方法

1.5.1免疫組織化學 大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液(0.3 mL/100 g)，待大鼠昏迷后，取出整個大腦置于冰上，立即分離出海馬組織。海馬組織4%多聚甲醛4℃過夜固定，常規方法石蠟包埋、切片，隨后常規二甲苯脫蠟和梯度酒精水化。3% H2O2室溫孵育10min，高溫高壓法抗原修復，10% BSA 37 ℃封閉40 min。滴加Klk7抗體(1∶200)和二抗(1∶100)孵育。DAB顯色劑室溫顯色15 min，自來水終止顯色。蘇木精染色40 s，1%鹽酸酒精分化3 s，藍化10 s，再次脫水透明后，中性樹膠封片。

1.5.2TUNEL染色 海馬樣品4%多聚甲醛4 ℃過夜固定，常規方法石蠟包埋、切片，隨后常規二甲苯脫蠟和梯度酒精水化。3% H2O2室溫孵育10 min。蛋白酶K室溫孵育20 min。滴加50 μL反應混合物，37 ℃濕盒中反應1 h。滴加50 μL轉化劑-POD，37 ℃濕盒中反應30 min，PBS清洗后，滴加DAB顯色劑顯色。蘇木精染色3 s，中性樹膠封片。

1.5.3HEK-293T細胞培養 HEK-293T細胞使用含10% FBS的DMEM培養基，在37 ℃、5%CO2條件下培養。待細胞生長至80%～90%密度時，0.25%胰酶溶液消化傳代。

1.5.4雙熒光素酶報告實驗 利用microRA.org靶基因預測軟件預測miR-326在Klk7 mRNA上的結合位點，構建Klk7 3′-非編碼區(3′-UTR)野生型(WT)和突變型(MUT)的報告基因質粒，分別轉染至穩定表達miR-326 mimic和NC的293T細胞中，37 ℃、5% CO2條件下培養48 h。應用Dual-Luciferase Reporter Assay System試劑盒，檢測各組螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性。

1.5.5海馬神經元細胞培養 D-Hanks沖洗空白對照組和CUMS組大鼠海馬CA1區組織并將其剪碎，0.25%胰酶溶液37 ℃條件下孵育，將其消化成細胞團或單個細胞。500 r/min離心5 min，棄上清，加入大鼠神經元細胞完全培養基重懸細胞，并將細胞密度調整至2×106個/mL，轉移至細胞培養瓶，37 ℃，5%CO2條件下培養，待細胞密度達到80%～90%時，0.25%胰酶溶液消化傳代。

1.5.6細胞轉染 將HEK-293T細胞(或海馬神經元細胞)按照5×104個/孔的密度接種至6孔板中，37 ℃、5%CO2條件下培養24 h后進行細胞轉染。根據LipofectamineTM 2000說明書進行miR-326 mimic、miR-326inhibitor、NC和siRNA-Klk7的轉染。37 ℃、5%CO2條件下培養48 h后，進行后續實驗。轉染序列見表1。

表1 轉染序列Table 1 Transfection sequence

1.5.7Western blot 收集轉染后的HEK-293T細胞(或海馬神經元細胞)，RIPA裂解液裂解細胞，取上清。BCA法測定蛋白濃度。取30 μg蛋白進行SDS-PAGE，將目的蛋白轉至PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉3 h，Klk7(1∶500)、p38(1∶1 000)、p-p38(1∶1 000)、JNK(1∶1 000)、p-JNK(1∶1 000)、ERK1/2(1∶1 000)、p-ERK1/2(1∶1 000)和GAPDH(1∶10 000)抗體4 ℃過夜孵育，HRP標記二抗(1∶2 000)37 ℃孵育1 h。ECL法發光、曝光，凝膠成像系統采集圖像。

1.5.8實時熒光定量PCR Trizol法提取轉染后的HEK-293T細胞(或海馬神經元細胞)總RNA，測定各樣品RNA濃度，并反轉錄成cDNA。按照SYBR○RPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明書配制反應體系，檢測miR-326表達和Klk7 mRNA表達。反應條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環；95 ℃ 15 s；60 ℃ 30 s；95 ℃ 15 s。以GAPDH和U6為內參，2-△△Ct法計算miR-326表達和Klk7 mRNA表達。實驗所需引物序列見表2。

表2 引物序列Table 2 Primer sequences

1.5.9流式細胞術檢測細胞凋亡 將海馬神經元細胞接種于6孔板內(5×104個/孔)，37 ℃，5%CO2條件下培養24 h，37 ℃，5%CO2條件下繼續培養48 h。收集細胞，70%乙醇4 ℃過夜固定。5 μL RNaseA(10 mg/mL)37 ℃處理1 h，Annexin V 和PI 37 ℃避光孵育1 h，流式細胞儀檢測細胞凋亡。將轉染后的海馬神經元細胞接種于96孔板(5×103個/孔)，每組設置3個重復，37 ℃、5%CO2條件下培養。24，48，72 h后分別加入10 μL CCK-8 37 ℃條件下孵育3 h，酶標儀測定450 nm吸光度。

1.6統計學方法 應用SPSS 21.0統計軟件分析數據。計量資料采用獨立樣本t檢驗、單因素方差分析、SNK-q檢驗以及重復測量的方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1CUMS處理對SD大鼠行為學的影響 造模結束后，檢測各組大鼠SP值、穿越次數和靜止時間，結果顯示，與空白對照組相比，CUMS組大鼠SP值、穿越次數均顯著下調，靜止時間顯著上調，差異有統計學意義(P<0.05)，說明抑郁癥大鼠模型造模成功。見表3。

表3 2組大鼠SP值、穿越次數和靜止時間的比較Table 3 Comparison of sucrose preference,crossing times and resting time between two groups

2.2CUMS處理對大鼠海馬組織Klk7表達和細胞凋亡的影響 免疫組織化學和TUNEL染色結果顯示，與空白對照組相比，CUMS組大鼠海馬組織中Klk7表達和細胞凋亡率均顯著上調，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠Klk7表達和細胞凋亡率的比較Table 4 Comparison of KLK7 expression and apoptosis rate in each group

2.3siRNA-Klk7干擾效率篩選 實時熒光定量PCR和Western blot結果顯示，與NC組相比，siRNA-Klk7-1和siRNA-Klk7-2組Klk7 mRNA和蛋白表達均顯著下調(圖1，P<0.05)，其中siRNA-Klk7-1下調效果更明顯，因此選取siRNA-Klk7-1進行后續實驗，簡稱為siRNA-Klk7。見表5。

圖1 Western blot檢測Klk7蛋白表達

表5 各組細胞Klk7 mRNA和蛋白表達的比較Table 5 Comparison of Klk7 mRNA and protein expression in each group

2.4miR-326靶向調控Klk7 microRNA靶基因預測軟件microRA.org分析結果顯示，Klk7基因是miR-326的潛在靶點，miR-326種子序列5′-CUCUGGG-3′ 與Klk7序列5′-CCCAGAG-3′ 靶向結合。熒光素酶報告基因實驗結果顯示，miR-326 mimic可顯著降低野生型Klk7基因3′-UTR報告基因的相對熒光素酶活性差異有統計學意義(P<0.05)，而對突變型3′-UTR報告基因的相對熒光素酶活性無顯著影響(P>0.05)。見表6。

表6 各組細胞熒光素酶活性的比較Table 6 Comparison of luciferase activity in each group

2.5miR-326靶向Klk7對CUMS大鼠海馬神經元細胞增殖的影響 實時熒光定量PCR和CCK-8結果顯示，與空白對照組相比，CUMS組細胞miR-326表達和活力顯著下調(P<0.05)，Klk7 mRNA表達顯著上調(P<0.05)；與NC組相比，上調miR-326 或下調Klk7，會顯著上調細胞活力(P<0.05)，下調miR-326則會上調Klk7 mRNA表達，下調細胞活力(P<0.05)；與miR-326 inhibitor組相比，同時下調miR-326和Klk7，會顯著上調細胞活力(P<0.05)。各組CD的表達量在組間、時點間、組間·時點間交互作用差異均有統計學意義(P<0.05)。見表7～8。

表7 各組細胞miR-326和Klk7 mRNA表達的比較Table 7 Comparison of miR-326 and Klk7 mRNA expression in each group

表8 各組細胞OD值的比較Table 8 Comparison of OD values of cells in each group

2.6miR-326靶向Klk7抑制CUMS大鼠海馬神經元細胞凋亡 流式細胞術結果顯示，與空白對照組相比，CUMS組大鼠海馬神經元細胞凋亡率顯著上調；與NC組相比，miR-326 mimic組和siRNA-Klk7組大鼠海馬細胞神經元凋亡率顯著下調，miR-326 inhibitor組顯著上調；與miR-326 inhibitor組相比，miR-326 inhibitor+siRNA-Klk7組大鼠海馬神經元細胞凋亡率顯著下調，差異有統計學意義(P<0.05)。見表9。

表9 各組細胞凋亡率的比較Table 9 Comparison of apoptosis rate among groups

2.7miR-326靶向Klk7抑制CUMS大鼠海馬MAPK信號通路活化 Western blot結果顯示，與空白對照組相比，CUMS處理顯著上調Klk7和MAPK信號通路相關基因蛋白表達；與NC組相比，上調miR-326 或下調Klk7后細胞Klk7和MAPK信號通路相關基因蛋白表達顯著下調，下調miR-326則產生相反變化；與miR-326 inhibitor組相比，同時下調miR-326 和Klk7后細胞Klk7和MAPK信號通路相關基因蛋白表達顯著下調，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖2和表10。

圖2 miR-326靶向Klk7抑制CUMS大鼠海馬MAPK信號通路活化

表10 各組細胞中MAPK信號通路相關蛋白表達的比較Table 10 Comparison of MAPK signaling pathway related protein expression in each group

3 討 論

抑郁癥是一種常見的精神病，其特征是悲傷忍耐、自我價值低落、缺乏興趣或幸福、精力不足或感到疲倦、睡眠不足、食欲不振和注意力不集中，世界約3億人受其影響。 最近的流行病學研究表明，到2030年，抑郁癥可能是疾病負擔的主要原因[10]。抑郁癥除了導致情緒狀態外，還導致認知缺陷[11]。盡管我們在探究抑郁癥的發病機制方面已經取得了巨大進展，但其發病機制仍不明了，還需要進一步研究。調節炎癥的Klks是多用途酶，參與皮膚和肺部炎癥，神經炎癥和炎癥性關節炎等疾病進展[6]。本研究旨在探究miR-326靶向Klk7通過MAPK信號通路對抑郁模型大鼠海馬神經元細胞的影響，以期為抑郁癥的治療提供新的科學資料。

細胞凋亡是抑郁癥發病機制中的關鍵介質[12]。近年來的研究表明，Klks在許多人類疾病中都存在著表達失調的現象，Klk7過表達導致人類黑素瘤細胞進一步惡化，發展為更惡性的表型，在黑色素瘤浸潤中起著重要促進作用[13]。除此之外，Klk7的表達升高與胃癌細胞侵襲性增強有關[14]。Klk7在卵巢癌中過度表達，并且參與卵巢癌的發生發展[15]。目前，關于Klk7在退行性疾病中作用的研究較少。本研究結果顯示，抑郁癥大鼠海馬神經元細胞凋亡率上調，通過檢測Klk7表達顯示，抑郁癥大鼠海馬中Klk7表達上調。該結果表明，Klk7可能在抑郁癥大鼠中發揮重要作用。

miRNA參與各種各樣的調節途徑，包括發育、病毒防御、造血過程、器官形成、細胞增殖、細胞凋亡和脂肪代謝等[16]。有研究證明， miR-29-5p 通過靶向結合 KLK7來調控甲狀腺乳頭狀癌細胞增殖，侵襲、遷移和凋亡[17]。miR-326過表達可增強阿爾茨海默癥老鼠神經元細胞活力并抑制神經元凋亡[18]。本研究結果表明，miR-326靶向調控Klk7表達，miR-326在抑制抑郁癥大鼠中低表達，過表達miR-326可通過抑制Klk7表達促進海馬神經元細胞，抑制細胞凋亡。已有研究表明，在抑郁患者和抑郁樣嚙齒類動物模型中，MAPK信號通路表達異常[19]。MAPK信號通路參與海馬神經元細胞凋亡的調控，抑制p38 MAPK信號通路可有效改善缺氧缺血性腦損傷新生大鼠的學習記憶能力和運動功能，減少海馬組織神經元凋亡，從而促進神經元的恢復[20]。在抑郁癥小鼠中，海馬p-JNK和p-p38蛋白表達上調，MAPK途徑被激活[21]。miR-326過表達可通過JNK信號通路增強神經元細胞活力并抑制神經元凋亡[18]。本研究結果顯示，抑郁癥大鼠海馬神經元細胞miR-326表達顯著下調，Klk7表達顯著上調，MAPK信號通路被激活；miR-326通過靶向Klk7抑制MAPK信號通路活化。

綜上所述，miR-326通過靶向Klk7抑制MAPK信號通路，促進CUMS大鼠海馬神經元細胞增殖并抑制凋亡，抑制炎癥因子的產生，從而發揮神經保護作用。miR-326是否通過靶向Klk7調控其它信號通路發揮對抑郁癥大鼠的改善作用還有待進一步研究。