IL-12B基因啟動子區異常甲基化與卵巢子宮內膜異位癥的發病風險相關性研究

趙 瑋，李 琰，郝雅麗，張海波，康 山*

(1.河北醫科大學第四醫院預防保健處，河北 石家莊 050011;2.河北醫科大學第四醫院腫瘤研究所分子生物學研究室，河北 石家莊 050011;3.河北醫科大學第四醫院生殖科，河北 石家莊 050011;4.河北醫科大學第四醫院婦科，河北 石家莊050011)

子宮內膜異位癥(endometriosis，EMs)是一種常見的婦科良性疾病，該病影響著全球約1.5億以上的婦女，是指具有活性的子宮內膜組織(腺體和間質)出現在子宮體以外的部位，并在該部位種植、生長。異位內膜組織可以侵犯全身任何部位，其中以卵巢和宮骶韌帶最常見。EMs的主要癥狀包括痛經、不孕、性交不適等。EMs雖然是一種良性疾病，卻有類似惡性腫瘤的生物學行為如：種植、侵襲和遠處轉移等。迄今為止，EMs的發病機制尚不明確。近年來的研究發現DNA啟動子區的異常甲基化導致的相關基因的異常表達在EMs的發生和發展中起著重要的作用。本課題組應用Illumina Human Methylation 450K甲基化芯片首次比較分析了6例卵巢EMs患者異位內膜組織和6例對照婦女正常子宮內膜組織的DNA甲基化狀態[1]。其中白細胞介素12B(interleukin-12B,IL-12B)基因啟動子區CpG島甲基化水平在異位內膜組織和對照組婦女正常內膜組織中存在顯著差異。因此，在本研究中擴大樣本量應用焦磷酸測序技術進一步分析驗證卵巢EMs患者的異位內膜和對照婦女正常子宮內膜組織中IL-12B基因啟動子區甲基化水平及mRNA表達水平的差異，以期進一步明確IL-12B基因表觀遺傳學改變在卵巢EMs發生發展中的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究共納入50例卵巢EMs患者和44例因宮頸上皮內瘤變Ⅲ級(CINⅢ)行全子宮切除的患者(對照組)。所有研究對象均來自2014年10月—2016年5月在河北醫科大學第四醫院婦科行腹腔鏡和開腹手術治療的患者。所有卵巢EMs患者均經手術證實EMs Ⅲ期或Ⅳ期，且均經術后病理證實為卵巢EMs，年齡29～50歲，平均(39.76±6.47)歲。取其異位卵巢巧克力囊腫的囊壁組織為異位內膜組。對照組年齡29～50歲，平均(40.30±6.24)歲，取其子宮內膜組織為正常內膜組，所有內膜組織均經病理證實為正常內膜。兩組手術時期均為月經周期的分泌期(依據末次月經時間及病理特征所見)。兩組均為育齡期女性，術前6個月未服用激素類藥物，均未合并子宮內膜病變、內分泌疾病、自身免疫性疾病及其他卵巢良惡性腫瘤等。標本取自患者術中的無菌離體組織，并迅速浸泡在盛有0.8 mL RNA later液的凍存管中，于4 ℃冰箱中過夜后置于-20 ℃冰箱里低溫長期保存。

標本及病例資料收集均經患者及家屬知情同意，并獲醫院倫理委員會批準。

1.2組織RNA的提取和實時熒光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR) 異位內膜組和正常內膜組IL-12B RNA應用Trizol試劑盒提取。應用逆轉錄試劑盒(Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit)將總RNA逆轉錄成cDNA。應用QIAGEN生物技術公司的QuantiNova TMSYBR Green PCR試劑盒進行qRT-PCR反應技術檢測組織中IL-12B基因mRNA的表達水平。IL-12B基因上下游引物分別為5′-CCCTGACATTCTGCG-TTCA-3′和5′-AGGTCTTGTCCGTGAAGACTC-TA-3′。內參磷酸甘油醛脫氫酶(reduced glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase，GAPDH)上下游引物分別為5′-ACCACAGTC-CATGCCATCAC-3′和5′-TCCACCACCCTGTT-GCTGTA-3′。反應參數：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸25 s，共40個循環。所有溶解曲線均為單峰。 mRNA 表達量計算公式：2-△△CT，△CT=CT(目的基因)- CT(管家基因)。

1.3組織DNA 提取及甲基化水平的檢測 異位內膜組和對照內膜組IL-12B DNA采用美國Promega公司的Wizard Genomic DNA純化試劑盒提取DNA。應用Nanodrop 2000檢測所提取DNA的濃度及純度。當標本A260 nm/A280 nm的比值在1.8～2.0時表示合格。采用焦磷酸測序技術(北京昂立信生物科技有限公司)檢測所有組織DNA標本IL-12B基因啟動子區的甲基化水平。引物由PyroMark Assay Design Software 2.0(Hua Da,Shen Zhen,China)設計見表1。應用Pyrodequencing檢測儀(PyroMark Q96 ID，QIAGEN)進行甲基化特異性PCR，Pyro Q-CpG軟件分析9個CpG位點(CpG1-9)的甲基化狀態。CpG1位于轉錄起始位點(transcription start site，TSS)上游95 bp，CpG2-9位于TSS上游1 444 bp到1 499 bp。

表1 焦磷酸測序中的PCR擴增引物序列Table 1 Primer sequences for pyrosequencing

1.4統計學方法 應用SPSS 21.0軟件包處理數據。 計量資料比較采用Wilcoxon秩和檢驗；計數資料比較采用χ2檢驗。采用Spearman相關系數分析IL-12B基因啟動子區甲基化與其mRNA表達水平的關系。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1IL-12B基因啟動子區在異位內膜組織和正常內膜組織中的甲基化狀態 IL-12B基因啟動子區的CpG1位點的甲基化水平在異位內膜組織和正常內膜組織中分別為52.060 (5.718)和62.640 (6.438)，兩者比較差異有統計學意義(Z=-7.547，P<0.001)。CpG2-9位點的甲基化水平在異位內膜組織和正常內膜組織中差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 異位內膜組織和正常內膜組織中IL-12B 基因啟動子區CpG2-9位點的甲基化水平Table 2 Methylation levels of CPG2-9 in the IL-12B gene promoter region in ectopic and normal endometrium tissues [M(QR)]

2.2異位內膜組織和正常內膜組織中IL-12B基因mRNA的表達水平 異位內膜組織和正常內膜組織中IL-12B基因mRNA的表達水平分別為22.639 (392.693)和0.975 (2.992)，兩者比較差異有統計學意義(Z=6.054，P<0.001)。

2.3相關性分析 采用Spearman相關系數分析，IL-12B基因啟動子區的甲基化水平與其mRNA的表達水平在統計學上存在明顯負相關性(r=-0.510，P<0.001)。

3 討 論

DNA甲基化是真核生物調控基因表達的主要表觀遺傳學修飾方式，發生在啟動子區的DNA甲基化可以直接阻止轉錄因子與DNA結合，也可以通過改變染色體的結構從而調控基因的表達[2]。DNA甲基化具有可遺傳的、可逆的、動態的特點，不僅可以建立特定的細胞狀態，還可以對微環境的變化作出反應，從而賦予細胞可塑性。這種變化可以在不同的生物液體中檢測到，如血液、尿液和糞便樣本[3]。在表觀遺傳修飾檢測中，基于DNA甲基化檢測是第一個被美國食品藥品監督管理局批準的結腸直腸癌篩查試驗[4]，這表明甲基化分析可以作為一種無基因檢測手段在臨床實施，將其應用于不同疾病類型的臨床篩查試驗。既往的研究發現包括EMs在內的許多人類疾病與基因啟動子區的異常甲基化狀態有關。基質金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP2)[5]、雌激素受體β(estrogen receptor β，ERβ)[6]、孕酮受體B(progesterone receptor B，PGR)[7]、Twist[8]，谷胱苷肽S轉移酶M1(Glutathione S-transferase M1，GSTM1)[9]等基因啟動子區的異常甲基化狀態均被證實在EMs的發生發展中發揮著重要的作用。本研究結果也顯示，與正常內膜組織相比，卵巢EMs患者異位內膜組織中IL-12B基因啟動子區呈現明顯的低甲基化狀態。而其mRNA的表達水平則明顯高于正常內膜組織的表達水平，且IL-12B基因mRNA的表達水平與IL-12B基因啟動子區的甲基化水平呈明顯負相關性。

IL-12B基因編碼IL-12p40亞基，IL-12p40亞基是IL-12和IL-23的組成部分。IL-12p40和IL-12p35亞基通過二硫鍵組成的具有異源二聚體結構的IL-12[10]。IL-12是連接先天性免疫和獲得性免疫的重要的橋梁分子，是機體抵御病毒和病原微生物的關鍵細胞因子，促進原始T淋巴細胞向Th1細胞轉化，增強細胞毒性T細胞(cytotoxic T cell，CTL)和自然殺傷細胞(natural killer，NK)的活性，被認為最強的NK細胞激活因子。在惡性黑色素瘤[11]、乳腺癌[12]、肺癌[13]和肝癌[14]中均被證實有明顯抑制腫瘤細胞生長的作用。游離的IL-12p40亞基被認為是IL-12的一個天然拮抗劑，IL-12p40的同源二聚體能夠與IL-12競爭結合IL-12R進而抑制IL-12的功能[15]。已有研究表明IL-12通過激活NK細胞的活性參與了EMs的初級防御，從而抑制子宮內膜異位癥的發生。Somigliana等[16]將IL-12注入C57BL/6和BALB/c EMs小鼠模型的腹腔內，發現異位病灶的面積和重量會顯著減少，說明IL-12在活體內能夠抑制EMs的發展。而Itoh等[17]則進一步證實，IL-12可以通過激活NK細胞的活性進而抑制腹腔內異位病灶的發展。然而，目前關于EMs患者腹腔液中IL-12表達水平的研究結果不盡相同。研究顯示，與正常對照者比較，EMs患者腹腔液中IL-12的含量明顯降低[18-19]。而Singh等[20]和魏靜波等[21]卻得出了完全相反的研究結果。但是，Mazzeo等[22]研究認為腹腔液中IL-12的濃度在EMs組和對照組間差異無統計學意義，而EMs患者腹腔液中游離IL-12p40的濃度卻明顯高于對照組。而且EMs的嚴重程度與IL-12+游離IL-12p40/IL-12的比值呈正比。IL-12能夠增強NK細胞對子宮內膜細胞的清除能力，而IL-12p40通過競爭結合NK細胞上的IL-12R抑制NK細胞的細胞毒作用，從而增加子宮內膜異位癥的發病風險。梁華等[23]也認為腹腔液中IL-12p40水平的增高與子宮內膜異位癥的發生有關。本研究結果顯示，IL-12B基因啟動子區甲基化水平及mRNA表達水平在異位內膜組織和正常內膜組織之間存在明顯的差異。并且IL-12B基因啟動子區甲基化水平和mRNA表達水平之間存在明顯的負相關性，mRNA表達水平的差異可能進一步影響IL-12p40蛋白的表達水平，從而導致了子宮內膜異位癥的發生。該結果與前期甲基化芯片篩查的結果一致。同時，應用Jaspar軟件(http://jaspar.genereg.net/)分析發現IL-12B基因啟動子區甲基化位點CpG1(cg18307303)處可能存在一個轉錄因子Sp1的結合位點。該位點的甲基化水平的改變可能會影響Sp1與啟動子區的結合，進而影響IL-12B基因mRNA的表達水平。因此，認為IL-12B基因啟動子區異常甲基化水平可能是通過影響其mRNA表達水平而在卵巢EMs的發生和發展過程中發揮著重要的作用。在今后的研究中，將進一步明確異位內膜組織和正常內膜組織及腹腔液中IL-12p40蛋白的表達水平。

本研究存在一定的局限性。課題選取因CINⅢ而行開腹或腹腔鏡下行全子宮切除術的患者，雖然所有內膜組織均經病理證實為正常子宮內膜，但是CINⅢ是否對基因啟動子區的甲基化水平有影響還未見報道。在以后的研究中尚需進一步來分析其影響。

綜上所述，異位內膜組織中IL-12B基因啟動子區的低甲基化水平可能通過上調其mRNA的表達水平，進而引起IL-12p40蛋白表達增加，從而增加了婦女患卵巢EMs的風險。本研究也進一步證明了EMs可能是一種表觀遺傳學疾病。尋找EMs甲基化差異基因有助于在分子水平上揭示其發病機制，為EMs的治療提供新的靶點。