氣相色譜電子捕獲法在檢測藥品中氯代乙烷類毒性雜質中價值

薛毅博，孫紅濤，王佳佳

駐馬店市食品藥品檢驗所藥理室，河南 駐馬店 463000

藥品中的雜質，為無任何療效的物質，且可能引起患者出現副作用［1］。因此，必須嚴格控制雜質水平，以確保藥品的安全性達到人體用藥的要求。根據ICH指南［2］，原料藥的雜質主要分為有機雜質、無機雜質和殘留溶劑三個類別，而在這三類中，遺傳毒性雜質安全閾值較低，甚至在低濃度的情況下發生突變，從而可能損傷DNA［3］。Benigin等［4］歸納總結了具有遺傳毒性警示結構。但目前，僅有少數文獻報道了關于藥品中氯代乙烷類化合物含量的檢測方法。氣相色譜儀電子捕獲檢測器是一個選擇性較好、靈敏度超高的檢測器，它只對含鹵素、硫、磷等的物質有超強的信號，并且要檢測的物質電負性越強，它的檢測靈敏度也就越高［5］。SYL930［6］是一種選擇性S1P1受體激動劑，由中國醫學科學院藥物研究所研發，由于它可以明顯改善體內的外周血淋巴細胞水平，所以通常用于對類風濕性關節炎患者的治療，但在合成SYL930的過程中很可能產生氯代乙烷類毒性雜質。因此，本研究建立了一種氣相色譜電子捕獲法分析方法，同時檢測SYL930原料藥中可能存在的1，1，2，2-四氯乙烷、1，1-二氯乙烷和1，2-二氯乙烷等3種氯代乙烷類毒性雜質，靈敏度較高，現報告如下。

1 材料

儀器：帶有ECD的氣相色譜儀（安捷倫科技有限公司），DB-624（30 m×0.53 mm，3.0μm）色譜柱（北京慧安清檢測科技有限公司），MSA225S電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司）。

藥品：1，2-二氯乙烷（GCS，99.6%）、1，1，2，2-四氯乙烷（GCS，99.9%）、1，1-二氯乙烷（GCS，99.5%）；N-甲基吡咯烷酮（NMP，色譜純，99.5%）；SYL930原料藥（批號：SNT20140402，SNT20140404）。

2 方法及結果

2.1 色譜條件

色譜柱的起始柱溫設置為35℃，溫度持續4 min以后，以15℃/min的速度快速升到100℃，然后以20℃/min的速度升高溫度到230℃，持續20 min。之后采用純度≥99.99%的高純氮氣，柱的流速設置為4.5 mL/min，分流比設置為5∶1，立即進樣，進藥量為1μL。

2.2 制備溶液

2.2.1 對照品溶液的制備：精密稱量1，2-二氯乙烷100 mg，放入50 m L量瓶中，之后用NMP定容并搖勻得到1，2-二氯乙烷溶液。精密稱量1，1，2，2-四氯乙烷10 mg，置于100 mL量瓶中，用NMP定容并充分搖勻后將該溶液定量稀釋100倍，制得1，1，2，2-四氯乙烷溶液。精密稱量1，1-二氯乙烷100 mg，放到10 mL量瓶后用NMP定容，充分搖勻后制得1，1-二氯乙烷溶液。

2.2.2混合對照品溶液的制備：精密量取上述的1，2-二氯乙烷溶液、1，1-二氯乙烷溶液各1 mL，并精密量取1，1，2，2-四氯乙烷溶液5 mL，置于100 mL量瓶中，之后用NMP定容至刻度并充分搖勻制得混合對照品溶液。精密量取1 mL上述混合對照品溶液放入10 mL量瓶中，然后用NMP定容并充分搖勻后制得混合的對照品溶液。

2.2.3供試品溶液的制備：準確稱量200 mg供試品倒入1 mL量瓶中，然后用適量的NMP溶液進行超聲溶解處理，之后用NMP定容至刻度并充分搖勻得到供試品溶液。

2.2.4系統適用性溶液的制備：準確稱量200 mg供試品放于1 mL量瓶中，精密量取0.1 mL上述混合對照品溶液后倒入到上述量瓶中，然后用NMP定容至刻度并充分搖勻后制得系統適用性溶液。

2.3 溶液穩定性的檢測

取適量的上述混合對照品溶液，按照上述“2.1”項的色譜條件，每隔2 h測定一次，共測12次，即24小時，分別記錄氯代乙烷類化合物各組分的峰面積，結果顯示1，1，2，2-四氯乙烷、1，1-二氯乙烷、1，2-二氯乙烷的RSD值分別為1.8%，0.89%，1.6%，表明在24 h內混合對照品溶液的穩定性良好。

2.4 標準曲線

精密量取上述混合對照品溶液，按照不同比例用NMP定量稀釋此溶液，制得不同濃度混合對照品溶液，然后按照“2.1”項色譜條件測定后得到3種化合物的色譜圖，峰面積作為縱坐標，各化合物的濃度作為橫坐標，采用線性回歸分析方法，見表1。

表1 氯代乙烷類化合物的標準曲線

2.5 精密度的測定

分別精密量取上述對照品溶液適量，將每種溶液按照不同比例定量稀釋成高、中、低3種不同濃度的溶液，按照“2.1”項色譜條件進行檢測分析，并且每種濃度的溶液平行4份，詳細記錄色譜峰并用峰面積來計算精密度大小，見表2。

表2 氯代乙烷類化合物的精密度

2.6 最小檢測限和最小定量限

取適量的上述混合對照品溶液，用NMP稀釋得到適當濃度的溶液，以“2.1”項色譜操作標準進行進樣，以信噪比（S/N）作為樣品的最小檢測濃度標準，以各個組分線性范圍的最低濃度表示化合物的最小定量濃度。取適量的氯代乙烷類化合物溶液后定量稀釋至3種化合物濃度均為定量限的15倍，得到驗證溶液。準確稱量供試品200 mg，放入1 mL量瓶后取適量的NMP進行超聲溶解處理，加入100μL上述驗證溶液，加NMP到刻度處，充分搖勻后按照“2.1”項色譜條件進行含量測定，見表3。

表3 氯代乙烷類化合物的最小檢測限和最小定量限

2.7 含量的檢測

精密稱取200 mg供試品放到1mL量瓶中，平行實驗3份，采取適量的NMP進行超聲溶解處理后，再用NMP稀釋至刻度并充分搖勻，按照“2.1”項色譜條件進行檢測分析，詳細記錄色譜圖，采用外標法來計算峰面積，以此來表示含量。結果發現，在原料藥SYL930中未檢測出含有1，1，2，2-四氯乙烷、1，1-二氯乙烷和1，2-二氯乙烷等毒性雜質。

3 討論

本研究建立了SYL930原料藥中1，1，2，2-四氯乙烷、1，1-二氯乙烷和1，2-二氯乙烷等氯代乙烷類化合物的氣相色譜電子捕獲法檢測，優化了色譜的檢測條件。

本研究采用DB-624色譜柱，因為該色譜柱峰形對稱且比較窄，無拖尾現象［7］，可以實現對氯代乙烷類化合物的有效分離；本研究采用ECD檢測器，因為要分離的化合物含有氯原子，在該檢測器上比較靈敏。本研究采用以15℃/min升溫，因為當以15℃/min升溫時，氯代乙烷類化合物的各組分形成的峰形較窄，并且可以實現氯代乙烷類化合物與NMP和供試品中的雜質峰分離完全［8］；本研究對于溶液的制備，采用準確稱量、精密量取的操作方法，用NMP定容至刻度，目的是使檢測結果更可靠、更具有說服性；本研究采用5:1的分流比，因為進藥量過大會引起色譜的污染且還會引起基線噪聲的增加［9］。本研究發現1，1，2，2-四氯乙烷在2.096～42.56 ng/mL、1，1-二氯乙烷在0.1078～10.69μg/mL、1，2-二氯乙烷在0.02136～2.136μg/m L范圍內，線性關系均良好，且相關系數均大于0.999；上述三種化合物的在低、中、高濃度的RSD值0.9%～4.7%，說明該方法精密度良好；1，1-二氯乙烷的最小檢測濃度為27 ng/m L、最小檢測限度為0.83μg/g，相比于其他兩種化合物均較高，檢測結果發現原料藥中的3種氯代乙烷類化合物最小定量限均＜1 ppm，且信噪比＞10，符合檢測基因毒性雜質的需要［10］，可十分有效地檢測原料藥中的各組分，從而可以檢測藥物的有毒雜質。

綜上所述，故采用氣相色譜電子捕獲法、用DB-624色譜柱建立的方法檢測氯代乙烷類毒性雜質專屬性良好、靈敏度較高、準確度和精密度較好，值得推廣應用。