不同非釀酒酵母與釀酒酵母混合發酵對脆紅李酒品質的影響

張曼，鐘濤，魏雪，闞建全，武運，FERENC Hegyi，杜木英*

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715)2(中匈食品科學合作研究中心，重慶，400715)3(新疆農業大學 食品科學與藥學學院， 新疆 烏魯木齊，830052)4(匈牙利國家農業研究和創新中心食品科學研究所，匈牙利 布達佩斯，H-1022)

脆紅李是中國李選育的晚熟品種，主要種植于西南地區[1]。脆紅李口感爽脆，營養豐富，酚類物質含量高，具有較強的抗氧化作用[2]。果酒是近年來水果精深加工的主要方向之一，具有酒精含量低、風味獨特、營養價值高等特點，深受消費者的青睞。果酒的口感和香氣與釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)密不可分[3]。

目前市面上尚無李子專用釀酒酵母，李子酒多采用商業釀酒酵母釀造。在使用商業釀酒酵母的同時會給李子酒帶來風味同質化、果香不突出、缺乏典型性等問題[4]，從而導致產品經濟效益下降。越來越多的研究表明采用非釀酒酵母(non-Saccharomycescerevisiae)與釀酒酵母混合發酵能夠豐富果酒香氣，提高果酒品質。LI等[5]發現戴爾有孢圓酵母(Torulasporadelbrueckii)與S.cerevisiae混合發酵樹莓酒，能夠增加揮發性酯類、萜類和酮類物質；尤雅等[6]發現扁平云假絲酵母(Candidahumilis)與S.cerevisiae混合發酵葡萄酒，不僅降低了乙醇含量還能提高β-大馬士酮的含量。目前，混合發酵的研究對象多集中在葡萄酒，而關于其在李子酒方面的研究鮮少。劉曉柱等[7]發現異常威克漢姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)與S.cerevisiae混合發酵空心李果酒，能夠降低果酒總酸,但對酒體香氣提升不明顯。因此，篩選出適宜的非釀酒酵母與S.cerevisiae混合發酵對脆紅李果酒的開發具有積極意義。

本文比較分析了4株常見非釀酒酵母包括熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)、東方伊薩酵母(Issatchenkioorientalis)、美極梅奇酵母(Metschnikowiapulcherrima)、葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniasporauvarum)與商業釀酒酵母D254混合發酵的脆紅李酒在發酵速率、理化指標、有機酸、揮發性成分及感官品質的差異，以期為生產優質脆紅李酒提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗原料為脆紅李，2020年9月購于本地超市。將脆紅李洗凈后打漿，經雙層無菌紗布過濾后放置于-20 ℃冰箱保藏備用。使用前在室溫下自然解凍，解凍后的脆紅李汁基本化學成分為初始糖度10.9 °Brix，總酸(以蘋果酸計)6.58 g/L，pH 3.34。

菌株：熱帶假絲酵母(C.tropicalis，CICC 31006)、東方伊薩酵母(I.orientalis，CICC 32163)、美極梅奇酵母(M.pulcherrima，CICC 32434)，中國工業微生物菌種保藏管理中心；葡萄汁有孢漢遜酵母(H.uvarum)，本實驗室保存；商業釀酒酵母D254，法國Lallemand公司。

蔗糖(食品級)，市購；YPD培養基，青島海博生物技術有限公司；3,5-二硝基水楊酸、氫氧化鈉(分析純)，成都科龍化工試劑廠；有機酸標準品，索萊寶生物科技有限公司；無水乙醇、2-辛醇標準品，上海阿拉丁生化股份有限公司。

1.2 儀器與設備

PH-100筆式酸度計，上海力辰邦西儀器科技有限公司；UV-1240紫外分光光度計、GC2010氣相色譜儀、LC-20A高效液相色譜儀、GCMS-QP 2010氣相色譜-質譜聯用儀，日本島津公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭，美國Supelco公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 混菌發酵試驗

脆紅李汁解凍后，添加蔗糖調整其初始糖度為20 °Brix，然后進行巴氏滅菌(70 ℃，15 min)，檢驗滅菌效果[8]。提前將發酵菌株接種于YPD培養基中活化，經搖床培養(28 ℃，180 r/min) 24 h后離心收集菌體，經無菌水洗滌2次后接入100 mL脆紅李汁中。非釀酒酵母接種量為107CFU/mL，釀酒酵母的接種量為106CFU/mL，接種方式為順序接種，即先接種非釀酒酵母，48 h后再接種釀酒酵母，以釀酒酵母單獨發酵為對照。發酵在帶橡膠塞和立式發酵栓的250 mL 錐形瓶中進行，(20±1)℃下靜置發酵。通過每天測定CO2失重量監測發酵進程[9]。主發酵結束后加入50 mg/L SO2，經8 000 r/min，10 min離心后棄菌體，上清液用于后續分析。

1.3.2 基本理化指標測定

pH采用pH計測定；酒精度、總酸、揮發酸參照GB/T 15038—2006測定，其中酒精度采用氣相色譜法[10]測定，總酸和揮發酸采用氫氧化鈉滴定法測定；還原糖采用3,5-二硝基水楊酸比色法測定[11]；色度和色調采用比色法[12]，色度=A420nm+A520nm+A620nm，色調=A420nm/A520nm。

1.3.3 有機酸含量測定

有機酸的測定參照李玉珠等[13]的方法。

1.3.4 揮發性成分測定

揮發性成分測定參考LU等[14]的方法。

1.3.5 感官分析

采用定量描述分析法對脆紅李酒的香氣成分進行評價。8位經過培訓的感官品評員(4男4女)依次根據經前期討論確定的感官描述詞(果香、花香、乙醇味、脂肪味、酸味)按照5點標度法對酒樣進行打分，0～5分表示感覺強烈程度逐漸增大。

1.3.6 數據分析

利用SPSS 19.0對數據進行方差分析，采用Duncan檢驗進行多重比較。分別采用Origin 2018和SMICA 14.0進行繪圖和主成分分析。

2 結果與分析

2.1 發酵動力學曲線

如圖1所示，釀酒酵母單獨發酵的發酵速率比與非釀酒酵母混合發酵的速率更快，對照組Sc在第10天完成主發酵過程，而實驗組需要12～13 d才能完成主發酵過程，延緩了發酵進程，這是非釀酒酵母的發酵能力相對較弱的體現[15]。在初始發酵階段(前2 d)Sc起酵速度更快，其次是C.tropicalis和I.orientalis，而M.pulcherrima和H.uvarum相對較慢。非釀酒酵母單獨發酵48 h后接種釀酒酵母，其發酵速率明顯上升，說明Sc在酒精發酵過程中起主導作用。發酵結束后，對照組Sc釋放9.63 g CO2，混合發酵實驗組釋放8.63～9.18 g CO2，其中Hu-Sc釋放的最多。

圖1 發酵動力學曲線Fig.1 Fermentation kinetics (CO2production) of the mixed and pure fermentations

2.2 混合發酵對脆紅李酒理化指標的影響

由表1可知，發酵結束后，各酒樣酒精度分別下降了6.77%、7.31%、4.11%、3.05%，可能是非釀酒酵母消耗了部分糖用于風味物質形成[16]。各酒樣揮發酸均符合GB 15037—2006規定(<1.2 g/L)，其中Io-Sc揮發酸含量相對較高，說明該株I.orientalis產揮發酸的能力較強，張文文等[17]也曾發現相同結果。顏色是脆紅李酒的重要感官品質之一，與消費者的接受程度密切相關[18]。除Mp-Sc外，其余混合發酵酒樣的色度和色調與對照組均存在顯著性差異，說明混合發酵能夠顯著影響果酒顏色。Mp-Sc中紅色成分(A520nm)含量較高，可能是由于M.pulcherrima能夠促進紅葡萄酒色素的穩定[19]，也可能是因為該株M.pulcherrima能夠產生紅色色素。

表1 脆紅李酒的基本理化指標Table 1 Physio-chemical indicators of Cuihongli plum wines

2.3 混合發酵對脆紅李酒有機酸的影響

有機酸的種類和含量是影響脆紅李酒風味品質的重要因素。與Sc單獨發酵相比，混合發酵對脆紅李酒中大多有機酸影響顯著，且不同菌株之間存在差異。混合發酵后脆紅李酒中的蘋果酸含量顯著降低，表明4株非釀酒酵母均具有良好的蘋果酸降解能力[20-21]，其中Io-Sc下降幅度最大，蘋果酸降解率達到35.1%。蘋果酸含量的減少有利于削弱尖銳的生青味和澀味[22]。乳酸含量也顯著降低，適量乳酸能賦予酒體酸度柔和、圓潤，更利于酒體的穩定[23]。一般認為乙酸含量在0.20～0.70 g/L能夠增加果酒風味復雜性，超過0.80 g/L則會帶來苦味和醋酸味。Hu-Sc與Sc的琥珀酸含量無明顯差異，這與WEI等[24]報道H.uvarum能夠降低琥珀酸的結論不一致，可能與實驗原料和所用菌株有關。酒石酸和檸檬酸變化不顯著。

表2 脆紅李酒中有機酸含量 單位：g/L

2.4 混合發酵對脆紅李酒揮發性成分的影響

如表3所示，主發酵階段結束后從脆紅李酒中共檢測到28種揮發性成分，包括8種醇類、10種酯類、5種酸類、2種萜烯類以及3種其他物質。與Sc組(16種)相比，混合發酵(23、18、20、19種)獲得的香氣成分種類更多，說明發酵時間的延長能夠對脆紅李酒的風味多樣性發揮積極作用。

表3 脆紅李酒中揮發性成分的含量Table 3 Contents of volatile components in Cuihongli plum wines

高級醇是酒精發酵階段形成的主要副產物之一，當其含量低于300 mg/L時能夠增加果酒香氣復雜性[25]。在脆紅李酒的香氣組成中，醇類化合物含量最高，從5種脆紅李酒中分別檢測到8、5、6、6、5種高級醇，其中Ct-Sc組高級醇含量最高，其余樣品中高級醇的含量均低于Sc組。與對照組相比，混合發酵脆紅李酒的異丁醇含量顯著增加(除Io-Sc外)，但未達到其感覺閾值，所以不會增加果酒的生青味。異戊醇是脆紅李酒中含量最高的醇類物質，能夠賦予酒樣白蘭地或辛辣味，但超過一定范圍后也會對脆紅李酒的風味有不良影響。在Mp-Sc組中，苯乙醇和(E)-3-己烯-1-醇的含量顯著增加，增幅分別達到12.40%和119.00%。苯乙醇能夠為脆紅李酒帶來玫瑰、蜂蜜等香氣，(E)-3-己烯-1-醇能夠為脆紅李酒帶來青草香。

酯類物質是果酒特征香氣成分之一，通常可以賦予葡萄酒一定的花香、果香。5種脆紅李酒的酯類物質種類分別為9、6、8、9和7種，其中Io-Sc酯類含量最高，達到2 255.61 μg/L，乙酸乙酯是該樣品最主要的酯類物質，占比超過90.00%，并且僅有乙酸己酯的香氣活度值(odor activity value，OAV)>1，可推斷該酒樣香氣在組成上不協調。主發酵結束后，各實驗組的酯類含量分別是對照組的1.22、4.12、3.59、1.81倍。具體體現在乙酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、水楊酸甲酯、鄰苯二甲酸二異丁酯的含量顯著提升，其中辛酸乙酯(花香、香蕉)、癸酸乙酯(果香、花香)、月桂酸乙酯(脂肪、果香)的OAV>1，對脆紅李香氣貢獻更為顯著。

果酒中的脂肪酸主要來源于酵母菌和乳酸菌代謝，低濃度時散發奶酪、奶油的風味，濃度過高則會帶來醋酸味、刺激味和腐敗味[26]。在本實驗中共檢測到5種酸類，其中乙酸和辛酸為共有成分，乙酸的產生與維持細胞內氧化還原平衡密切相關[27]，辛酸是酵母發酵過程中合成細胞膜所需長鏈脂肪酸的剩余片段[28]。2-甲基丁酸僅在Io-Sc組被檢出，且其含量超過閾值(OAV>1)，會帶來酸味、干酪等不良氣味。總體而言，混合發酵后，酸類物質總量顯著降低，其帶來的不良影響降低，更有利于脆紅李酒香氣的平衡。

萜烯類化合物香味濃郁，感官閾值低，對果酒香氣成分的有較大貢獻。在Sc與Hu-Sc2組中未檢測到萜烯類物質，其余樣品中均含有芳樟醇，且在Ct-Sc和Mp-Sc2組中芳樟醇OAV>1，能夠明顯賦予脆紅李酒花香。這一結果表明C.tropicalis、I.orientalis、M.pulcherrima3種菌株可能具有相對較高的糖苷酶活性，能夠讓以糖苷結合態形式存在的香氣物質轉變為游離態。除此之外，Ct-Sc中還檢測到香茅醇，可為脆紅李果酒提供玫瑰花香和甜香。

在酒樣中還檢測到了2,4-二叔丁基、3-甲硫基丙醇、1-庚烯，對豐富脆紅李果酒風味的復雜性有一定的貢獻。混菌發酵后，帶有生土豆味、脂肪味的3-甲硫基丙醇含量明顯減少。

2.5 主成分分析

一般認為，OAV>1的香氣物質是果酒的主要呈香物質。近年來，也有研究表明OAV>0.1 的香氣物質可作為潛在呈香物質，它們可以通過疊加與其類似的香氣化合物從而對果酒香氣產生積極效果[29]。為了直觀分析4種不同混合發酵脆紅李酒的香氣差異，對表3中OAV>0.1的12種香氣成分進行主成分分析。由圖2可知，前2個主成分累計方差貢獻率>80.00%，包含了原樣本中絕大多數信息。由(圖2-a)可知，5種脆紅李酒在置信區間內區分明顯，且混合發酵與對照組Sc都不在同一象限內，說明混合發酵能夠顯著影響脆紅李酒的風味。Ct-Sc與Hu-Sc位于同一象限且距離較近，說明在風味上具有一定的相似性， 與二者相關性強的揮發性成分是異戊醇。與Io-Sc相關性較強的揮發性成分是2-甲基丁醇和乙酸乙酯。與Mp-Sc組相關性強的揮發性成分主要包括了辛酸乙酯、癸酸乙酯、芳樟醇等，賦予脆紅李酒果香和花香。而Sc組與辛酸、2,4-叔丁基苯酚、棕櫚酸乙酯等的相關性較強，在增加風味多樣性的同時也帶來了不良風味。

a-主成分得分圖；b-載荷圖圖2 酒樣中OAV>0.1的香氣化合物的主成分得分圖 和載荷圖Fig.2 PCA score map and load map of volatile aroma compounds (OAV>0.1) in wine samples

2.6 感官評價

不同混合發酵的脆紅李酒感官評價雷達圖見圖3。由圖3可知，Mp-Sc組的果香和花香得分明顯高于Sc組，這是因為M.pulcherrima與S.cerevisiae混合發酵后顯著增加了脆紅李酒中酯類物質和萜烯類物質的含量，可賦予果酒香氣多樣性和復雜性。Io-Sc組總酯含量最高，但其體現出的果香相對較弱，這與混合酯間的組成比例密切相關[30]。Ct-Sc與Hu-Sc各項評分都較為接近，與主成分分析結果一致。在本次實驗中，Ct-Sc、Hu-Sc的感官得分較低，可能與菌株接種量、接種比例、接種順序等釀造條件有關，導致給脆紅李酒風味造成負面影響。總體來看，采用Mp-Sc混合發酵脆紅李酒時酒體具有較好的感官品質。

圖3 感官分析雷達圖Fig.3 Radar map of sensory analysis

3 結論

本實驗研究了C.tropicalis、I.orientalis、M.pulcherrima、H.uvarum分別與Sc順序接種混合發酵對脆紅李酒品質的影響。結果表明，與Sc單獨發酵(10 d) 相比，混合發酵延緩了發酵進程(12～13 d)。不同脆紅李酒的基本理化均符合國標，但Io-Sc中揮發酸含量較高，達到0.78 g/L。除Mp-Sc外，混合發酵對脆紅李酒的色度和色調有顯著影響。經混合發酵后脆紅李酒中的蘋果酸、乳酸和乙酸含量顯著降低，有利于果酒風味平衡。在香氣方面，Mp-Sc中辛酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、芳樟醇顯著提高，有利于增強酒體果香、花香。感官評價結果表明Mp-Sc的果香味和花香味較為濃郁，而Ct-Sc與Hu-Sc風味相對較弱，可能與釀造條件有關。綜上，M.pulcherrima更適合應用于混菌釀造脆紅李酒，有利于增加香氣復雜性，提升品質。后續課題組將會進一步對接種量、接種比例、接種順序等工藝參數進行優化，為生產優質的脆紅李酒提供參考依據。