鉛山縣CDC實驗室新型冠狀病毒核酸檢測工作分析評估報告

石小鳳 張春愹

摘要：目的 ?評估實驗室開展新冠病毒核酸檢測結果可靠性方法 對實驗室新冠病毒核酸檢測各環節影響檢測結果準確度的因素進行分析評估。結果 對實驗室檢測各個環節關鍵影響因素做好質量控制，實驗室儀器設備各項性能指標達到要求。結論 對采樣、檢測、試劑等做好質量控制，儀器性能優越，實驗室開展新冠病毒核酸檢測結果準確可靠。

關鍵詞：新型冠狀病毒核酸檢測影響因素 采樣環節 ?儀器精密度驗證 ?方法最低檢測限驗證

【中圖分類號】R563.1 ?【文獻標識碼】A ?【文章編號】1673-9026（2021）06-042-02

冠狀病毒根據血清型和基因組特點分為α、β、γ、δ4個屬。它們可以感染人類、哺乳動物、鳥類、蝙蝠等的呼吸系統、胃腸道、肝臟和中樞神經系統。目前，已知能夠感染人的冠狀病毒有7種，除去我國2003年暴發的（SARS-CoV）冠狀病毒和2012年中東暴發的中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERSr-CoV）以外，其余4種感染人的冠狀病毒（HCoV-NL63、HCoV-229E、HCoV-OC43和HKU1）可誘發輕微的上呼吸道感染，新型冠狀病毒SARS-Cov-2是繼上述6種外的第7個感染人的β屬冠狀病毒。SARS-Cov-2可以通過結合各種粘膜細胞上的血管緊張素轉化酶受體進入宿主細胞內，與外界相通的氣道粘膜、口腔粘膜，以及眼瞼，眼結膜均容易暴露感染。

實時熒光RT-PCR核酸檢測技術可高效、快速的完成病毒標本的檢測，兼具靈敏度高和特異性強的特點，而成為《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》中首推的檢測方法。

為應對新冠疫情，鉛山縣疾病預防控制中心于2020年8月組建了PCR基因擴增實驗室，截至2021年2月完成了包括重點人群，重點場所8000余份樣本的檢測。

以下，本人結合前期已開展的新型冠狀病毒核酸檢測工作，對可能影響新冠病毒核酸檢測結果的各環節影響因素做一分析評價。

一 采樣環節

影響檢測結果，造成假陰性的因素很多，其中之一為樣本環節，國家感染性疾病臨床醫學研究專家一份實驗室研究數據表明，陽性病例發病后0-7天采集的痰液、鼻咽拭子、口咽拭子3種類型的標本中，核酸檢測陽性率為60%，隨著病程的發展這3種類型標本陽性率有所降低，根據“新型冠狀病毒肺炎防控方案（第七版）”中“新型冠狀病毒肺炎實驗室檢測技術指南”采集標本的類型包括：鼻咽拭子、咽拭子、鼻咽抽取物或呼吸道抽取物、深咳痰液、支氣管灌洗液、肺泡灌洗液、糞便標本、肛拭子、血液標本、血清標本等。專家研究表明SARS-CoV主要感染下呼吸道和肺部，，病灶主要位于肺外帶近胸膜處，故在標本類型方面肺泡灌洗液、支氣管灌洗液、是較好的標本類型，但具創傷性和交叉污染的風險。痰液在各個不同檢測時間段陽性率為較高，在操作簡便性和安全性優于肺泡灌洗液，但臨床患者癥狀多以干咳、無痰為主。此外，鼻咽拭子優于口咽拭子。

采樣過程人為操作不當;樣本收集的時間過早或過晚;沒有正確的保存、運輸和處理樣本;技術本身存在的原因，如病毒變異、PCR抑制等原因也是導致樣本檢測結果出現假陰性的因素。

病毒本身在體外很快就會裂解掉影響后續檢測，所以在保存及運輸時，就需要加入病毒保存液，目前病毒保存液分為滅活型和非滅活型兩種。

對于不同的檢測目的，需要使用不同的病毒保存液，目前廣泛使用的這兩種保存液各有特點。為了滿足不同的檢測要求，以及不同的病毒檢測實驗室條件，采用不同的保存液是非常有必要的。

滅活型保存液：主要是核酸提取裂解液改良的病毒裂解型保存液。采樣時內含高濃度的胍鹽即可高效滅活病毒，能有效阻止操作員二次感染，但是又含有Rnase抑制劑，能保護病毒核酸不被降解，從而使后續能通過NT-PCR進行檢測。而且能在常溫下保存相對較長的時間，節省了病毒樣品保存以及運輸的成本。

非滅活型保存液：主要是以運送培養基為基礎改良的病毒維持液型保存液。它能夠保持病毒在體外的活性以及抗原和核酸的完整性，含有Hanks液基礎，慶大霉素，真菌抗生素，BSA （V） ，冷凍保護劑、生物緩沖劑及氨基酸等，保護病毒蛋白質外殼不易分解，較大程度地保持了病毒樣本的原始性。這種保存液除了用于核酸提取檢測外，還能用于病毒的培養、分離以及抗原的檢測等，但是采樣后長時間保存需要保持嚴格低溫。

采樣環節所使用的病毒保存液是否符合要求也是保證檢測結果準確性的重要因素，目前，我中心新冠病毒核酸檢測主要使用的是山東天愛醫療器械有限公司生產的滅活型病毒采樣管，當檢測出陽性標本需再次采樣送上級培養分離時則采用非滅活型保存液。

二 檢測環節

（一）核酸提取

病毒核酸在裂解結合緩沖液存在的環境中釋放并與磁珠相結合，通過控制磁棒和磁套的運動實現磁珠的收集、釋放、轉移、進而完成核酸的整個提取過程。核酸提取過程主要包括以下幾個步驟：

⑴ 吸附：在樣品結合緩沖液中加入磁珠，充分振蕩混合，釋放出來的核酸吸附到磁珠表面。

⑵ 洗滌：將上述磁珠收集并轉移到洗滌緩沖液中，反復洗滌以除去夾帶的雜質。

⑶ 洗脫：把磁珠轉移到洗脫緩沖液中，充分振蕩混合后，目標核酸即從磁珠表面脫落并溶解到洗脫緩沖液中。

中心使用提取儀為上海之江生物醫藥科技有限公司生產的全自動磁珠核酸提取儀，型號EX3600型。提取試劑為上海之江生物科技股份有限公司生產。

在此結合日常工作，將此環節應注意的事項總結如下：

1 ?實驗開始前先清潔并消毒工作臺面、移液器等;

2 ?實驗操作時使用超凈工作臺，以防止對環境的污染;

3 ?操作時使用不含熒光物質的一次性手套，為避免交叉污染，手套必要時及時更換，使用一次性專用離心管、自卸式移液器和帶濾嘴的吸頭以及提取后應轉移至無DNA酶和RNA酶的EP管中等;

4 ?為避免因試劑成分不均引起的實驗結果不穩定，在使用前將試劑充分混勻，另外，預裝板使用前應短暫離心或輕甩，將E行液體全部至于孔底部。

（二）PCR擴增檢測

采用實時熒光PCR技術，以新型冠狀病毒2019-nCoV的RFlab和 N基因設計特異性引物和TaqMan探針，通過熒光定量PCR儀進行擴增，從而實現對新型冠狀病毒2019-nCoV核酸的檢測。

該步驟中影響檢測結果準確性的關鍵因素為儀器和檢測試劑的性能以及人員操作因素，中心目前使用的PCR擴增儀為美國伯樂CFX96Touch型PCR擴增儀，所使用擴增試劑為新型冠狀病毒 2019-nCoV 核酸檢測試劑盒（上海伯杰醫療科技有限公司）。

為了保證檢測結果的準確性，實驗室進行了系列實驗，用以對所使用的儀器和檢測試劑性能進行驗證。

（1）精密度驗證：兩個不同濃度的陽性參考品分兩組做實驗分別為A組，B組，每組做20個平衡樣，同時做陰陽對照。分析陽性參考品檢出率。統計其2019-nCoVORF1ab基因、N基因、和內參基因Cq值，計算精密度變異系數和陽性樣本符合率。

對兩組標本的數據進行分析：兩組陽性參考品ORF1ab基因、N基因和內參基因的檢出率為100%。統計其2019-nCoVORF1ab基因、N基因和內參基因Cq值，計算其精密度變異系數如表二、表三，變異系數均低于3%。說明儀器和試劑精密度性能能夠達到檢測要求。

（2）最低檢測限驗證：

檢測方法：取中國計量科學研究院的新型冠狀病毒核糖核酸基因組標準物質，參照標準物質說明書，對標準物質進行稀釋，分別稀釋至ORFlab： 500copies/mL>N： 500copies/mL;每個重復檢測20次。且陽性檢出率達到100%，即可作為預估的最低檢測限;

上海伯杰醫療科技有限公司“新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測試劑盒（熒光PCR法）”在ORFlab基因、N基因濃度為500copies/mL時，用Bio-Rad CFX96檢測，20個重復檢出率為100%，符合最低檢測限要求。

三 結論

綜上所述，在檢測過程中，對采樣、檢測、試劑等環節做好質量控制，儀器性能優越，能夠保證實驗室開展新冠病毒核酸檢測結果準確可靠。

參考文獻：

[1]中華人民共和國國家衛生健康委員會 新型冠狀病毒肺炎防控方案（第七版）

[2]李振昊 高小玲等 新型冠狀病毒核酸檢測分析[J]《檢驗醫學與臨床》 2020 ?年5月第17卷第10期 1313

[3]麗娟 陳大洋等 新型冠狀病毒核酸檢測的主要影響因素及控制措施[J]《臨床檢驗雜志》2020年3月38卷第3期223

[4]江西省疾控機構新型冠狀病毒核酸檢測工作手冊（試行）

鉛山縣疾病預防控制中心 ?江西上饒 ?334505