Luminal型與Basal-like型乳腺癌差異miRNAs的表達與預后分析

趙明娟，劉江波，袁芊芊，鄧 通，黃 橋，吳高松，方 程

1. 武漢大學中南醫院循證與轉化醫學中心（武漢 430071）

2. 河南科技大學第一附屬醫院甲狀腺乳腺腫瘤外科（河南洛陽 471000）

3. 武漢大學中南醫院甲狀腺乳腺外科（武漢 430071）

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，2020年世界衛生組織國際癌癥研究機構（IARC）最新發布的全球癌癥負擔數據表明，全球乳腺癌新發病例高達226萬例，超過肺癌成為全球第一大癌[1-2]。2012年我國新診斷乳腺癌占全球的12.2%，死亡病例占全球的9.6%，該數據源于中國國家癌癥登記中心，只有13%的中國人口被納入，可能低估了我國乳腺癌發病率和死亡率[3]。美國癌癥協會最新數據顯示，乳腺癌發病率以每年0.3%的速度緩慢增長，主要為Luminal 型乳腺癌[4]。

近年來，人們嘗試采用各種高通量分子技術探究乳腺癌的內在本質，根據其分子特征進行分類、治療及預后評估，其中基因表達譜技術的應用最受關注。Perou等于2000年首次通過基因表達譜聚類分析方法，將乳腺癌分為管腔上皮 A 型（Luminal A）、管腔上皮 B 型 （Luminal B）、HER-2 過表達型、基底樣型 （Basal-like） 和正常乳腺樣型 （Normal-like） 5種分子類型。此后，研究者開發了很多簡化模式如PAM50和SCMGENE等，來增強分子分型的實用性[5-7]。2011年St.Gallen專家組達成共識，采用雌激素受體（estrogen receptor, ER）、孕激素受體（progesterone receptor, PR）、人類表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor-2, HER2）、Ki67四種免疫組化標記來進行乳腺癌分子分型，將乳腺癌分為Luminal A型、Luminal B型、HER-2過表達型及三陰性乳腺癌 （triple-negative breast cancer，TNBC）[8-9]。之后的臨床研究，證實了它們在預后和治療反應等方面的特異性，受到廣泛認可。不同的分子分型在乳腺癌的治療和預后上存在一定的差異，其中Luminal A型乳腺癌預后最好，Luminal B型次之，Basal-like型乳腺癌預后最差[8-9]。

微小RNA（microRNA, miRNA）是一類長約22個核苷酸組成的非編碼單鏈RNA分子，通過與靶基因mRNA互補結合，從而參與基因表達轉錄后的調控[10]。有研究表明，miRNA的表達水平與乳腺癌的免疫組化、分子分型、預后及治療反應密切相關[11]。Shin等發現miR-199a-5p在三陰性乳腺癌組織中表達低于正常乳腺組織[12]。而Bockmeyer等采用聚類分析方法發現，相較于Luminal型乳腺癌，Basal-like型乳腺癌在miR-199a-3p中表達水平明顯上調[13]。在臨床上，Basal-like型乳腺癌較Luminal型乳腺癌藥物反應性和預后差，且易侵襲和轉移。為了探討Luminal型乳腺癌和Basal-like型乳腺癌間是否存在差異miRNAs導致這種差別，本文擬通過生物信息學方法，系統全面獲取和分析Luminal 型和Basal-like型乳腺癌之間差異表達的miRNAs，以期能找到在這兩類預后相差較大的乳腺癌中最相關的miRNAs。為以后兩類分子分型乳腺癌，尤其是Basal-like型乳腺癌的診斷和治療方面提供依據。

1 資料與方法

1.1 表達譜芯片數據的獲取

在美國國立生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information, NCBI）GEO數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中，以“microRNAs”和“breast cancer”為檢索詞進行檢索，并按照以下納入與排除標準進行篩選。納入標準：①miRNAs物種為人類；②數據集中必須同時包含Luminal型和Basal-like型乳腺癌樣本；③數據集根據PAM50劃分乳腺癌的分子分型。不同數據集、相同基因平臺時，取樣本量最大最全者。最后共納入2個數據集GSE81000與GSE40267，分別由芯片平臺GPL10656與GPL10850提供注釋信息。篩選并下載2個數據集中Luminal型和Basal-like型的乳腺癌miRNAs微陣列數據集，其中GSE81000中Luminal型乳腺癌 244例，Basal-like型 乳 腺 癌 45例；GSE40267中Luminal型和Basal-like型乳腺癌分別為20例和94例。

1.2 差異表達miRNAs的篩選

利用GEO2R在線分析工具（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/?），分析 Luminal型和Basal-like型2組乳腺癌的微陣列數據，以P＜0.05且差異倍數（fold change, FC）的絕對值≥1.5作為差異表達miRNAs的篩選標準。使用 Venn diagram webtool（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）篩選兩個數據集相交的miRNAs。兩個數據集共同的差異miRNAs被視為關鍵miRNAs。

1.3 差異表達miRNAs的靶基因預測

利用miRNAs靶基因預測數據庫mirDIP[14]（http://ophid.utoronto.ca/mirDIP/index.jsp#r）在線預測2組乳腺癌差異表達miRNAs的潛在靶基因，并根據Integrated Score值≥0.9篩選最相關的靶基因。

1.4 實時熒光定量PCR檢測差異表達miRNAs

人乳腺癌細胞系MCF-7與MDA-MB-468 來源于ATCC，采用10%胎牛血清的DMEM培養基于37℃恒溫孵箱中培養，選擇處于對數生長期的細胞進行實驗。采用TRIZOL分別提取MCF-7細胞與MDA-MB-468細胞的總RNA。利用反轉錄試劑盒（ELK Biotechnology）生成cDNA模板，再采用qRT-PCR試劑盒（ELK Biotechnology）檢測差異miRNAs的相對表達水平，以U6基因的mRNA作為內參基因。hsa-miR-199a-5p正向引物序列5'-CCCAGTGTTCAGACTACCTGTTC- 3'，反向引物序列5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTC-3'；hsa-miR-199b-5p正向引物序列5'-CCCAGTGT TTAGACTATCTGTTCCT-3'，反向引物序列5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTC- 3'。PCR擴增條件：預變性95℃3 min；循環段，95℃10s，58℃30s，72℃30s，循環40次。數據采用2-ΔΔCT法進行分析。

1.5 不同分子分型乳腺癌差異表達miRNAs的生存分析

利用METABRIC數據庫（http://www.cbiopor tal.org/study/summary?id=brca_metabric），對Breast cancer miRNA中979例 Luminal型乳腺癌組織樣本（其中Luminal A型546例、Luminal B型433例）和203例Basal-like型乳腺癌組織樣本，在hsamiR-199a-5p和hsa-miR-199b-5p中的差異表達進行生存分析。

1.6 統計分析

通過R語言的Pheatmap包對篩選出來最相關靶基因進行可視化分析。采用SPSS 20.0處理PCR數據，兩組間采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05具有統計學差異。對METABRIC數據庫中篩選樣本采用Kaplan-Meier Plotter（http://kmplot.com/analysis/index.php?p=service&cancer=breast_mirna）進行生存分析，針對所有可能值分組進行Cox回歸，將最小P值對應的分界值確定為最佳cut off 值，P＜0.05具有統計學差異。

2 結果

2.1 差異表達miRNAs的獲取

采用GEO2R分析工具，根據篩選標準，從數據集GSE81000與GSE40267中共篩選出896 條差異miRNAs，其中人源miRNAs 878條，最終在兩個數據集中篩選出35種關鍵miRNAs，詳見圖1。相較于Luminal型乳腺癌，有18種miRNAs在Basal-like型患者中表達下調，17種miRNAs表達上調（表1）。

表1 利用GEO2R在線分析工具篩選獲得差異表達的關鍵miRNAsTable 1. The Key differentially expressed miRNAs were screened by GEO2R online analysis tool

圖1 兩個數據集差異表達miRNAs韋恩圖Figure 1. Venn diagram of differential expression of miRNAs in two data sets

2.2 差異表達miRNAs的靶基因預測

靶基因預測數據庫mirDIP檢索并篩選結果顯示，35種關鍵miRNAs的潛在靶基因共4 180個，最相關的靶基因有19個，其中5個靶基因（SLC24A3、MYRF、PODXL、CELSR1、CAPRIN1）由miR-199a-5p與miR-199b-5p共同靶向。使用R語言Pheatmap包進行可視化分析，結果如圖2所示。

圖2 利用靶基因預測數據庫mirDIP預測差異表達miRNAs的最相關靶基因結果Figure 2. The most relevant target genes of predicted differentially expressed miRNAs by target gene prediction database mirDIP

2.3 實時熒光定量PCR檢測差異表達miRNAs

采用qRT-PCR檢測人乳腺癌細胞MCF-7（Luminal型）和MDA-MB-468（Basal-like型）細胞中miR-199a-5p與miR-199b-5p的表達水平。與MCF-7細胞相比，MDA-MB-468細胞中miR-199a-5p與miR-199b-5p表達水平均呈下降趨勢，但差異不具有統計學意義（P＞0.05）。

2.4 不同分子分型乳腺癌生存分析

利用METABRIC數據庫分析546例Luminal A型、433例Luminal B型及203例Basal-like型乳腺癌組織樣本中miR-199a-5p和miR-199b-5p的表達水平與患者總體生存率的關系，發現miR-199a-5p與miR-199b-5p表達水平與不同分子分型乳腺癌的預后具有相關性。在Luminal型乳腺癌患者中，miR-199a-5p（P=0.003，cut off值 為 9.26）與 miR-199b-5p（P<0.001，cut off值為 9.23）低表達與Luminal A型乳腺癌患者的總生存率降低相關，具有統計學差異，生存分析結果見圖3A和圖3B。而在Luminal B型乳腺癌中無統計學意義，詳見圖3C和圖3D。盡管在Basal-like型乳腺癌患者中，miR-199a-5p與miR-199b-5p表達與其預后相關性無統計學差異（P＞0.05），但在miR-199a-5p與miR-199b-5p高表達的Basallike型乳腺癌患者總生存率的整體趨勢高于低表達的患者，生存曲線見圖3E和圖3F。

圖3 A、C和E分別表示Luminal A型、Luminal B型和Basal-like型乳腺癌在miR-199a-5P中表達水平與預后生存率的關系；B、D和F分別表示Luminal A型、Luminal B型和Basal-like型乳腺癌在miR-199b-5P中表達水平與預后生存率的關系Figure 3. Kaplan–Meier overall survival analyses for the miR-199a-5p expressed in the (A) Luminal A, (C) Luminal B, (E) Basal-like breast cancer patients，and the miR-199b-5p expressed in the (B)Luminal A, (D) Luminal B, (F) Basal-like breast cancer patients

3 討論

乳腺癌在分子水平具有高度異質性，不同分子分型的乳腺癌患者對治療反應各不相同。4種主要分子分型的乳腺癌患者預后有顯著差異，其中Luminal A型乳腺癌預后最好， Basal-like型乳腺癌預后最差。乳腺癌的早期診斷對改善預后至關重要。隨著醫學技術的發展，分子生物標志物如ER、PR和HER-2，已充分用于診斷和預測腫瘤預后[15]。但這些生物標志物存在一定局限性，不能從外周血直接獲取。

miRNA可以調控細胞增殖、分化、凋亡、腫瘤微環境、侵襲和遷移，在乳腺癌的發生和發展中具有重要作用[16-17]。再加上miRNA在血液中的穩定性、無創性、特異性和可測量性[18-19]，使其成為乳腺癌診斷、治療和預后預測理想的生物標志物。不同于以往的小樣本研究，本研究整合了來自不同人群的2個miRNA微陣列數據集，通過生物信息學方法分析Luminal 型和Basallike型乳腺癌之間差異表達的miRNAs。最終篩選出35種差異表達的關鍵miRNAs，其中18種miRNAs 在Basal-like型乳腺癌相較于Luminal型乳腺癌中表達下調，17種表達上調。靶基因預測獲得潛在靶基因共4 180個，最相關的靶基因有19個，與其密切相關的miRNAs是miR-199a-5p和miR-199b-5p。采用qRT-PCR檢測其在乳腺癌細胞MCF-7和MDA-MB-468細胞表達水平，結果顯示與MCF-7細胞相比，MDA-MB-468細胞在miR-199a-5p與miR-199b-5p表達水平均呈下降趨勢。目前雖然也有研究表明miR-199a-5p與miR-199b-5p低表達與乳腺癌總生存率顯著降低相關，但研究多聚焦TNBC[20-23]。TNBC并不等同于Basal-like乳腺癌，TNBC中還包含20% Non-basal-like乳腺癌[24]。因此，miR-199a-5p和miR-199b-5p表達水平與Basal-like乳腺癌和Luminal乳腺癌預后關系尚未得到評估。本研究側重于探討miR-199a-5p和miR-199b-5p的表達水平與Basal-like和Luminal型乳腺癌患者預后的關系。生存分析結果顯示，miR-199a-5p與miR-199b-5p低表達與Luminal A型乳腺癌患者的總生存率降低顯著相關。而Luminal B型乳腺癌患者預后卻與miR-199a-5p與miR-199b-5p表達水平無關。盡管無統計學差異，Basal-like型乳腺癌患者總生存率在miR-199a-5p與miR-199b-5p低表達時亦呈現降低的趨勢。有研究表明，miR-199a-5p可靶向Ets-1（E-Twenty-Six-1）的3'-UTR降低β1整合素水平，從而通過FAK/Src/Akt/mTOR信號通路減輕乳腺癌的侵襲[25]。Lin等研究發現miR-199b-5p具有抗血管生成作用，通過直接靶向激活素受體樣激酶1（activin receptor-like kinase 1,ALK1），提示miR-199b-5p可能是一個潛在的抗血管生成的乳腺癌治療靶點[26]。

本研究通過生物信息學分析，確定了35個在Luminal 型和Basal-like型乳腺癌中差異表達的關鍵miRNAs，可能在乳腺癌的個體化治療中發揮重要作用。其中，miR-199a-5p、miR-199b-5p與Luminal A型乳腺癌的預后相關，有望成為其治療的新靶點。相關miRNA在乳腺癌分子分型中的調控機制有待進一步研究。

利益沖突 本研究所有作者均無利益沖突。