胃癌黏膜組織miR-127、PALB2表達與臨床特征及預后的相關性研究

陸霞娟，蔣海峰，馬晶晶

上海市楊浦區控江醫院消化內科，上海 200093

胃癌是現今世界上最常見的癌癥之一，起源于胃部黏膜上皮的惡性腫瘤，具有高發病率、高病死率和預后差等特點，浸潤程度、淋巴結轉移等因素都是其致死因素。有研究發現，胃癌患者中有10%以上的病例顯示出家族遺傳史，人們至今仍為研究其潛在的機制及尋找生物標志物和治療靶點而努力[1-2]。胃癌患者因多為晚期確診，通常表現為預后不佳，因此，找到胃癌的診斷生物標志物及隨訪復查至關重要。越來越多的證據表明，微小RNA(miRNAs)在胃癌等各類癌癥發生中具有重要作用，許多miRNAs已被作為治療胃癌的潛在靶點[3-4]。近期有研究報道微小RNA-127(miR-127)可作為腫瘤抑制劑，抑制骨肉瘤細胞的增殖和遷移[5]。還有研究發現，miR-127可抑制胃癌的轉移和侵襲[6]。乳腺癌易感基因相關蛋白2(PALB2)是一種乳腺癌基因，自2015年以來有多項研究為PALB2及其他參與同源重組DNA修復的基因在胃癌風險中的作用提供依據[7-8]。但關于miR-127和PALB2在胃癌黏膜組織中的表達水平與臨床特征及預后相關性的研究鮮少報道。因此，本研究旨在探討胃癌黏膜組織中miR-127、PALB2的表達與臨床特征及預后的相關性，以期為胃癌的病情發展及預后監測提供有效依據，為進一步探討胃癌的發生機制提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2013年3月至2015年7月本院收治且已確診為胃癌患者120例作為研究對象，其中男67例、女53例，年齡34～82歲。納入標準：(1)患者經鏡檢、活檢等手段檢查確診(患者均為胃體部發生潰瘍、結節隆起病變，少數表現為糜爛、菜花樣腫物)[9]，臨床資料完整；(2)全部患者均進行手術切除治療，術前未進行其他輔助性治療。排除標準：(1)經內鏡及活檢確診為食管胃交界部腺癌、原發性惡性淋巴瘤、胃肉瘤患者[9-10]；(2)在近期進行過化療或手術等治療的胃癌患者；(3)患有其他免疫系統疾病患者。本研究通過本院倫理委員會批準，經患者和家屬知情并簽署同意書。

1.2儀器與試劑 高速低溫離心機(JW-3021HR)購自嘉文設備有限公司；熒光定量PCR儀(LightCycler?96)購自上海羅氏診斷產品有限公司；全自動酶標儀(RT2100C)購自德國IFP公司。UltraSYBR Mixture(Low ROX)[貨號：(CW0956)]購自康為世紀公司；RNA提取試劑盒(貨號：DP441)購自北京天根生化有限公司；PrimeScriptTMRT Master Mix(貨號：RR047AA)購自日本Takara公司。

1.3方法

1.3.1標本采集及保存 在手術中取研究對象胃癌黏膜組織和癌旁黏膜組織(>5 cm)，用生理鹽水清理干凈，放入-80 ℃冰箱備用。

1.3.2胃癌黏膜組織和癌旁黏膜組織中miR-127、PALB2相對表達水平檢測 使用RNA提取試劑盒(天根)提取出胃癌黏膜組織和癌旁黏膜組織總RNA后反轉錄成cDNA。以此為模板，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測標本中miR-127、PALB2相對表達水平。用U6、β-actin作為內參對mRNA標準化，通過2-ΔΔCt計算miR-127、PALB2相對表達水平。用Primer 6.0和Oligo 7軟件設計引物，引物長度為18～22 bp，擴增長度100～300 bp，見表1，送華大基因進行合成，經10倍稀釋備用。

表1 實時熒光定量 PCR 引物(5′-3′)

1.4隨訪 對出院患者進行為期5年的隨訪，以電話或復查形式記錄患者預后生存情況。

2 結 果

2.1癌旁黏膜組織和胃癌黏膜組織中miR-127、PALB2相對表達水平比較 癌旁黏膜組織中miR-127相對表達水平高于胃癌黏膜組織，而PALB2相對表達水平則低于胃癌黏膜組織，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 癌旁黏膜組織和胃癌黏膜組織中miR-127、PALB2相對表達水平比較

2.2miR-127、PALB2相對表達水平與胃癌臨床病理參數的關系 miR-127和PALB2相對表達水平分別以中位數0.23和2.02為標準，大于中位數為高表達組，低于或等于中位數為低表達組。由表3可知，兩組胃癌黏膜組織中miR-127和PALB2相對表達水平在不同性別、分化程度、年齡和腫瘤大小間比較，差異無統計學意義(P>0.05)，在淋巴結轉移、浸潤程度和TNM分期間比較差異有統計學意義(P<0.05)。

表3 miR-127、PALB2相對表達水平與胃癌臨床病理參數的關系(n)

2.3miR-127、PALB2相對表達水平與胃癌患者預后的關系 miR-127、PALB2相對表達水平與胃癌患者生存狀況的關系見圖1、2。經過5年隨訪后，120例患者24例生存，96例死亡，生存率為20.00%。miR-127高表達組生存率為30.00%，miR-127低表達組生存率為10.00%，差異有統計學意義(P<0.05)；PALB2低表達組生存率為31.67%，而PALB2高表達組生存率為8.33%，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.4COX生存回歸分析影響胃癌患者預后的因素 將淋巴結轉移、TNM分期、浸潤程度、PALB2相對表達水平和miR-127相對表達水平進行單因素COX生存回歸分析，發現以上5個因素均對患者預后存在影響(P<0.05)。多因素分析發現，淋巴結轉移、TNM分期、浸潤程度、PALB2高表達和miR-127低表達均是影響胃癌患者預后的獨立危險因素(P<0.05)。見表4。

注：1為高表達組；2為低表達組；3為高表達組-檢剔后；4為低表達組-檢剔后。

表4 胃癌患者預后的COX生存回歸分析

注：1為高表達組；2為低表達組；3為高表達組-檢剔后；4為低表達組-檢剔后。

3 討 論

胃癌是除了肝癌和肺癌之外的第三大致命性癌癥，因大多數患者患病晚期才得到確診，導致預后不佳，因此病死率較高[11-12]。在解剖學上，胃癌分為胃腺癌和胃食管交界處腺癌，在組織學上可分為彌散型和腸型[11]。胃癌的患病風險因素有病毒感染、性別、年齡、飲酒史等，現今也有大量關于胃癌遺傳性的研究，以期在胃癌預防和治療方面取得突破性的進展[13]。張瀟怡[14]在關于胃癌易感性和預后相關基因的研究中發現MSH6、MLH11和MUTHY等基因與胃癌的發生有關。

miRNAs是一種非編碼的單鏈小分子RNA，在真核生物細胞中廣泛存在，可在轉錄后水平調節基因表達，其表達異常可導致細胞異常分化和過度增殖，從而引發癌變[15]。彭洪等[16]研究表明，miR-127-5p高表達對結直腸癌細胞增殖起抑制作用，其在癌變組織中的表達水平低于正常組織。還有研究表明胃癌發生與miR-127的表達異常有關，通過蛋白印跡分析miR-127的表達發現，胃癌組織中其表達水平低于正常組織[17]。本研究結果發現，與癌旁黏膜組織相比，胃癌黏膜組織中miR-127相對表達水平降低，與上述研究結果一致。這表明miR-127可對胃癌的癌細胞起抑制作用，其表達降低可導致腫瘤細胞增殖[16]。此外，本研究還發現，胃癌黏膜組織中miR-127相對表達水平在性別、分化程度、年齡和腫瘤大小間比較，差異無統計學意義(P>0.05)，在淋巴結轉移、浸潤程度和TNM分期間比較差異有統計學意義(P<0.05)，這表明miR-127可影響胃癌的發生、發展。miR-127高表達組生存率為30.00%，miR-127低表達組生存率為10.00%，差異有統計學意義(P<0.05)，且miR-127低表達是預后不良的獨立危險因素。這表明miR-127可作為預后監測指標用以跟蹤病情發展狀況。

PALB2是一種乳腺癌基因，其突變可增加患乳腺癌的風險[18-19]。還有研究表明PALB2會增加患胃癌的風險，是一種癌癥易感基因[8]。本研究結果發現，與癌旁黏膜組織相比，胃癌黏膜組織中PALB2相對表達水平增加，并且PALB2相對表達水平在淋巴結轉移、浸潤程度和TNM分期間比較，差異有統計學意義(P<0.05)。這表明其相對表達水平增加可致使腫瘤的發生。PALB2低表達組生存率為31.67%，而PALB2高表達組生存率為8.33%，差異有統計學意義(P<0.05)。多因素分析發現，PALB2高表達是影響預后的獨立危險因素。以上結果表明，PALB2作為新的家族性胃癌基因，可對胃癌的治療和預防重要作用。

綜上所述，本研究發現胃癌黏膜組織miR-127低表達、PALB2高表達，二者與臨床特征密切相關，且PALB2高表達和miR-127低表達均是影響胃癌患者預后的獨立危險因素。以上結果表明，miR-127、PALB2具有作為胃癌患者預后不良生物標志物的潛在能力，但兩者在胃癌中的詳細作用機制還需進一步研究。