福林酚法測定檀香橄欖中總多酚含量的研究

吳曉青，孫燕麗，鐘碧萍

（福建生物工程職業技術學院，福建 福州350007）

橄欖又名青果，為橄欖科植物橄欖（Canarium album Raeusch.）的果實，是一種藥食兩用的水果［1］。有研究表明：橄欖中所含的主要成分為多酚類化合物，如沒食子酸、并沒食子酸、短葉蘇木酚等，具有增強免疫、抗氧化、抗病毒、抗菌消炎、鎮痛、解酒護肝、抑制血糖升高、增加骨密度和骨鈣含量、抗乙肝病毒等作用［2-4］。 福建橄欖產量居全國之首，故開發橄欖多酚產品對帶動和促進橄欖的產業化發展具有重要意義。 目前對于橄欖總多酚含量測定的方法多采用福林酚（folin-ciocalteu，FC）法，但隨著產地或品種的不同，試驗條件各不相同［5-7］。 檀香橄欖是橄欖科橄欖屬下的植物，為福建省名貴的果樹，原產于閩清縣安仁溪一帶，宋朝開始栽培，已有數百年的栽培歷史，現已發展到閩侯、福州郊區、長樂、連江、永泰、莆田、仙游及漳浦等地栽培。 故本研究建立FC 法測定檀香橄欖中總多酚的含量，為進一步篩選閩產橄欖品種，開發橄欖多酚產品提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 UV-1800PC DS2 型紫外可見分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）；AL 204 電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；KQ-600GKDV 型高功率恒溫數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SHA-B 恒溫振蕩器（常州國華電器有限公司）；DS-1 高速組織搗碎機（上海精科實業有限公司）。

1.2 試藥 檀香橄欖（產地：福建閩清，經福建中醫藥大學中藥鑒定教研室范世明高級實驗師鑒定為橄欖科植物橄欖（Canarium album Raeusch.）的果實；沒食子酸對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號 B20851，純度≥98%）；碳酸鈉、FC、無水乙醇等試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 供試品溶液的制備 取橄欖鮮果適量，去核，60 ℃熱風干燥，粉碎（過40 目篩），即得橄欖粉末；精密稱取橄欖粉末約1 g，加60%乙醇溶液30 mL，40 ℃水浴超聲提取25 min，趁熱過濾，取2 mL 濾液至50 mL 量瓶中，加水稀釋至刻度，即得供試品溶液。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取沒食子酸對照品0.100 8 g，置 100 mL 量瓶中，蒸餾水溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得1 mg／mL 沒食子酸對照品貯備液；精密吸取對照品貯備液2.5 mL 至100 mL 量瓶中，蒸餾水稀釋至刻度，即得濃度約為25 μg／mL的沒食子酸對照品溶液。

2.3 測定波長的選擇 分別精密量取供試品溶液和對照品溶液適量，分別置于刻度離心管中；加FC試劑 2.0 mL、10%碳酸鈉6 mL，搖勻，加水稀釋至25.0 mL，在30 ℃恒溫振蕩器中反應1 h，以溶劑試劑為空白，反應后在600～900 nm 波長范圍掃描。結果表明：兩種溶液在765 nm 處均有最大吸收峰，故選擇 765 nm 為測定波長。 結果見圖1。

圖1 對照品溶液和供試品溶液吸收光譜圖

2.4 FC 法測定條件的優化

2.4.1 FC 試劑用量的考察 取1.0 mL 供試品溶液至刻度離心管中，分別加入FC 試劑0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，加 10% Na2CO3溶液 6.0 mL，加水稀釋至25.0 mL，搖勻，在30 ℃恒溫振蕩器中反應1 h，于765 nm 處測定吸光度。 結果表明：當FC 試劑加入量為2.0 mL 時吸光度趨于穩定，故確定FC 試劑用量為 2 mL。 結果見圖2。

圖2 FC 試劑用量考察圖

2.4.2 10% Na2CO3溶液用量的考察 取1.0 mL 供試品溶液至刻度離心管中，加FC 試劑2.0 mL，分別加入 10% Na2CO3溶液 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mL，加水稀釋至25.0 mL，搖勻，在30 ℃恒溫振蕩器中反應1 h，于765 nm 處測定吸光度。 結果表明：當10% Na2CO3溶液加入量為4.0 mL 時吸光度達到最大，而加入量大于6.0 mL 時，吸光度反而開始下降。故確定10% Na2CO3溶液加入量為4.0 mL。 結果見圖3。

圖3 10% Na2CO3 溶液用量考察圖

2.4.3 反應溫度的考察 分別取1.0 mL 供試品溶液至刻度離心管中，加FC 試劑2.0 mL，再加入10%Na2CO3溶液 4.0 mL，加水定容至 25.0 mL，搖勻，分別在 30、40、50、60 ℃的恒溫振蕩器中反應1 h，于765 nm 處測定吸光度。 結果表明：相同時間內，在50 ℃恒溫振蕩器中反應的吸光度最大，反應最完全，故確定供試品溶液反應溫度為50 ℃。 結果見圖4。

2.4.4 反應時間的考察 分別取1.0 mL 供試品溶液至刻度離心管中，加入FC 試劑2.0 mL，10%Na2CO3溶液 4.0 mL，加水定容至 25.0 mL，搖勻，在50 ℃恒溫振蕩器中分別反應 15、30、45、60 min 后，于765 nm 處測定吸光度。結果表明：反應30 min 時吸光度達到穩定，故確定供試品溶液反應時間為30 min。 結果見圖 5。

圖4 反應溫度考察圖

圖5 反應時間考察圖

2.4.5 正交設計試驗與結果分析 為進一步考察各因素之間的交互作用，采用L9（34）正交試驗進一步優化，分別精密量取1.0 mL 供試品溶液，其他實驗條件一致，對 FC 試劑用量（A）、10% Na2CO3溶液用量（B）、反應溫度（C）和反應時間（D） 4 個因素進行優化。 實驗因素水平設計見表1，正交實驗結果見表2。

表1 因素水平表

表2 正交試驗結果

對表2 進行直觀分析可知：極差大小顯示各因素的影響作用依次為A＞B＞D＞C，最佳顯色條件為 A3B1C2D2，即 1.0 mL 供試品溶液中加 FC 試劑3.0 mL，10%碳酸鈉溶液 4.0 mL，40 ℃恒溫振蕩器中反應45 min。 由于反應條件最佳理論組合不在9 個實驗中，故追加驗證實驗。 取3 批次的供試品溶液，分別取1.0 mL，按最佳反應條件進行驗證實驗，反應后測得的吸光度（0.569、0.568、0.564）均略高于正交試驗中試驗號 7 的測定值（0.562、0.563、0.559），因最佳組合溫度更低，更節能，故選擇最佳理論組合作為FC 法測定閩產檀香橄欖總多酚含量的條件。

2.5 方法學驗證

2.5.1 標準曲線的制備及線性關系的考察 精密量取對照品溶液 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置刻度離心管中，按檀香橄欖總多酚含量測定的最佳條件，以溶劑試劑為空白，測定吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線，結果見圖6。回歸方程為：y＝0.1350x＋0.006 9，r＝0.999 7，表明沒食子酸在 1.008 0～5.040 0 μg／mL 范圍內具有良好的線性關系。

2.5.2 精密度實驗 分別精密吸取同一對照品溶液1.0 mL，共6 份，分別置刻度離心管中，按檀香橄欖總多酚含量測定的最佳條件，測定吸光度，吸光度分別為 0.569、0.567、0.559、0.562、0.565、0.564，RSD＝0.63%。 結果表明儀器精密度良好。

圖6 沒食子酸標準曲線圖

2.5.3 重復性實驗 精密稱取同一批閩產檀香橄欖粉約1 g，共6 份，按“2.1”項下和檀香橄欖總多酚含量測定的最佳條件測定吸光度值，計算閩產檀香橄欖總多酚含量，結果分別為7.80%、7.62%、7.59%、7.79%、7.72%和7.76%，檀香橄欖總多酚的平均含量為 7.71%，RSD＝1.18%。 結果表明該方法重復性符合要求。

2.5.4 穩定性實驗 取供試品溶液1.0 mL，按檀香橄欖總多酚含量測定的最佳條件，顯色后室溫下放置，于 0、2、4、6、8、12 h 測定吸光度，吸光度分別為0.565、0.568、0.569、0.567、0.564、0.560，RSD＝0.58%。結果表明反應后放置12 h 均穩定。

2.5.5 加樣回收率實驗 分別精密稱取同一批次檀香橄欖粉約0.5 g，共6 份，分別精密加入約38.55 mg沒食子酸對照品，按“2.1”項下和檀香橄欖總多酚含量測定的最佳條件測定吸光度值，計算回收率，結果見表 3。 結果表明該方法準確可靠，可用于檀香橄欖總多酚的定量分析。

表3 加樣回收率實驗結果

2.5.6 檀香橄欖中總多酚含量測定 分別取3 批次橄欖，每批次平行測定3 份，按“2.1”項下和檀香橄欖總多酚含量測定的最佳條件測定吸光度值，計算總多酚含量。 結果見表4。

表4 檀香橄欖中總多酚含量測定結果

3 討 論

FC 法是利用在堿性溶液中，酚類化合物可將鎢鉬酸還原（使W6+變為W5+），生成藍色的化合物，顏色的深淺與酚含量成正比的原理進行測定總多酚含量。 本實驗以閩清檀香橄欖為測定對象，首次采用單因素試驗結合正交試驗對FC 法的測定條件進行優化。 根據比爾定律，吸光度與吸光物質量的濃度成正比，對于同一供試品溶液，吸光度越大，說明反應越完全，故本實驗以吸光度作為衡量測定條件優劣的評價指標，建立了檀香橄欖中總多酚的含量測定方法。本實驗首次采用單因素結合正交實驗優化FC 法測定檀香橄欖總多酚的條件，充分考慮各因素的交互作用，建立的方法穩定、簡單、準確，可作為檀香橄欖總多酚含量的測定方法，為后續閩產橄欖多酚產品的開發奠定基礎。