補腎疏肝法對卵巢早衰大鼠下丘腦-垂體-卵巢軸的影響

王 洋，陳姝婷，朱景茹，卓澤偉，張 斐，王維斌，郭明章

（福建中醫藥大學中醫學院，福建 福州 350122）

卵巢早衰（primary ovarian failure，POF）是指 40 歲之前女性由于各種原因導致卵巢內卵泡破壞或耗竭從而發生卵巢功能衰竭，以促性腺激素升高、雌激素水平降低為特征的一類疾病， 臨床以月經不調、閉經、潮熱、盜汗、陰道干澀等為主要表現［1-2］。 中醫并無POF 病名，根據其癥狀歸屬于“月經量少”“經閉”“血枯”“不孕”等范疇［3］。西醫認為 POF 的發生主要與遺傳、自身免疫、代謝及醫源性損傷有關，中醫學認為POF 主要責之于腎精氣虧虛，肝郁氣滯，以致沖任虧虛，血海無源，發為本病［4］。有研究表明腎虛肝郁是造成卵巢早衰的主要病機［5-6］，本實驗通過觀察補腎疏肝法對POF 大鼠下丘腦-垂體-卵巢軸的調節作用以及對性激素的影響，以期為POF 的臨床防治提供理論依據。

1 材 料

1.1 實驗動物 8 周齡SPF 級雌性SD 大鼠共24 只，體質量150～180 g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，許可證批號：SCXK（滬）2017-0005。 大鼠飼養于福建中醫藥大學實驗動物中心SPF 屏障系統，控制溫度（24±2） ℃，濕度（55±10） %，自由攝食飲水，合格證編號：20170005005273。

1.2 藥物 補腎疏肝方為左歸飲合柴胡疏肝散合方，處方：熟地黃 9 g，山藥 6 g，枸杞子6 g，茯苓4.5 g，山茱萸 6 g，柴胡 6 g，制陳皮 6 g，白芍 4.5 g，枳殼 4.5 g，川芎 4.5 g，醋香附 4.5 g，炙甘草 4.5 g。中藥飲片均由福建中醫藥大學附屬第三人民醫院藥劑科提供，煎煮兩遍后用無菌紗布過濾3 次，濃縮至含生藥量0.693 g／mL 的湯劑。

1.3 試劑及儀器 環磷酰胺（山西普德藥業有限公司，批號：S30563）；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號：20201016）；大鼠卵泡刺激素（FSH）、雌二醇（E2）、促性腺激素釋放激素（GnRH）、促性腺激素釋放激素受體（GnRH-R）酶聯免疫吸附實驗（ELISA）檢測試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司，批號：M00272、ML002871、ML003375、ML003038）；RM2245 型切 片 機 （德 國Leica 公司）；Rayto RT-6100 酶標分析儀（雷杜生命科學股份有限公司）。

2 方 法

2.1 分組與造模 將24 只大鼠隨機分為空白對照組、模型對照組和補腎疏肝組，每組8 只。 除空白對照組外，其余 2 組以 50 mg／（kg·d）的首負荷劑量腹腔注射環磷酰胺，再以 8 mg／（kg·d）環磷酰胺連續腹腔注射14 d，建立POF 大鼠模型。

2.2 給藥方法 按照人與動物劑量常規換算法，即大鼠給藥劑量為人的6.3 倍計算，補腎疏肝組予補腎疏肝方湯劑 10 mL／（kg·d）灌胃，空白對照組和模型對照組予等體積生理鹽水灌胃，每日1 次，共4 周。

2.3 標本采集 實驗結束后，禁食禁水12 h 后麻醉，剖腹取腹主動脈血，斷頭處死。 將卵巢周圍的脂肪和結締組織都剝離干凈，清洗卵巢殘血，將其置于4%多聚甲醛溶液固定后4 ℃冰箱保存備用。 全血在室溫下靜置 3 h 后，3 000 r 離心 20 min， 抽提血清，分裝凍存于-20 ℃冰箱備用。

2.4 卵巢組織病理形態觀察 卵巢組織進行梯度乙醇脫水、浸蠟、包埋、切片、拷片，經脫蠟、HE 染色、水化、封片后，在光鏡下觀察3 組大鼠卵巢病理形態學變化。

2.5 血清 GnRH、GnRH-R、FSH、E2檢測 上述備用血清按照相應ELISA 試劑盒說明書步驟操作后放入酶標儀，用450 nm波長測定吸光度（OD 值），通過標準曲線計算樣本實際濃度，檢測GnRH、GnRH-R、FSH、E2水平。

2.6 統計學方法 采用SPSS 23.0 軟件處理數據。計量資料符合正態分布的以（）表示，采用單因素方差分析；不符合正態分布的采用秩和檢驗。

3 結 果

3.1 3 組大鼠卵巢組織病理形態 空白對照組卵巢組織結構清晰，可見各級卵泡，顆粒細胞層次多；模型對照組卵巢組織體積減小，內部結構破壞，閉鎖卵泡增多，成熟卵泡少；補腎疏肝組卵巢組織體積減小有所改善，閉鎖卵泡減少，可見各級卵泡。 見圖1。

3.2 3 組大鼠 GnRH、GnRH-R、FSH、E2水平比較見表1。

圖1 3 組大鼠卵巢組織HE 染色圖（×100）

表 1 3 組大鼠 GnRH、GnRH-R、FSH、E2 水平比較（）

表 1 3 組大鼠 GnRH、GnRH-R、FSH、E2 水平比較（）

注：與空白對照組比較，1） P＜0.01；與模型對照組比較，2） P＜0.01，3） P＜0.05。

組別空白對照組模型對照組補腎疏肝組GnRH-R／（pg／mL）1567.83±154.52 564.90±184.031）752.49±169.172）n 8 8 8 GnRH／（mIU／mL）42.68±7.92 100.09±5.111）80.16±4.402）FSH／（IU／L）5.66±0.83 12.41±0.811）9.50±0.852）E2／（pmol／L）62.59±6.24 24.30±3.541）38.45±7.583）

4 討 論

目前卵巢早衰的發病機制尚不明確，臨床上缺乏統一的治療標準。 中醫強調“整體觀念”與“辨證論治”，從多角度、多環節、多靶點靈活運用中藥，具有獨特的治療優勢和廣闊的運用前景［7］。 中醫認為卵巢具有“藏泄”的雙重功能，功能發揮主要依靠腎的封藏與肝的疏泄作用，腎精虧虛、肝失疏泄是卵巢早衰的主要病機［8-9］，因此，補腎疏肝法是防治POF 的關鍵。 補腎疏肝方由左歸飲合柴胡疏肝散組成。 左歸飲具有滋陰填精的功效，主治真陰不足證；柴胡疏肝散功能疏肝理氣，活血止痛，主治肝氣郁滯證。 二者合用，滋陰填精，疏肝行氣。

下丘腦-垂體-卵巢軸能夠調節女性的性激素水平，從而維持正常的生殖功能。 GnRH 由下丘腦分泌，GnRH-R 作為G 蛋白耦聯受體家族中的一員，可以介導GnRH 活性來調控垂體中FSH 的合成與分泌，使其到達卵巢后可誘導顆粒細胞分泌E2，促進子宮內膜向增殖期轉變，加速卵巢卵泡的生長、發育、成熟以及排卵［10-11］。 FSH 是臨床常見的反映卵巢功能的指標，E2水平升高對垂體FSH 起負反饋調節作用，中樞與外周之間形成有效的反饋與負反饋調節，使女性性激素水平始終維持在動態的平衡狀態［12-13］。 本實驗結果顯示：① 補腎疏肝法能夠調節POF 大鼠性激素水平。 與空白對照組比較，模型對照組FSH 升高，E2降低，提示POF 大鼠模型建立成功。經補腎疏肝法治療后的POF 大鼠血清FSH下降（P＜0.01），E2升高（P＜0.05），說明大鼠性激素水平紊亂得到一定改善，提高了卵巢對激素的敏感性。 ② 補腎疏肝法對POF 大鼠HPG 軸具有顯著調節作用。 POF 大鼠 GnRH 水平升高，GnRH-R 水平降低，排卵功能受到抑制。經補腎疏肝法治療后，可明顯降低 POF 大鼠 GnRH 分泌水平（P＜0.01），升高GnRH-R 分泌水平（P＜0.05）。③ 補腎疏肝法能明顯改善POF 大鼠卵巢形態。 POF 大鼠卵巢內部結構破壞，閉鎖卵泡增多，卵泡生長、成熟停滯。補腎疏肝法能改善卵巢內部結構，使閉鎖卵泡減少，生長卵泡增加，同時促進各級卵泡的成熟。

綜上分析，補腎疏肝法治療POF 大鼠的作用機制可能與調控下丘腦-垂體-卵巢軸功能狀態從而調節大鼠性激素水平，糾正內分泌紊亂，促進卵巢修復，卵泡生長、成熟有關。 本實驗目前研究了補腎疏肝法對POF 大鼠病理形態和內分泌激素水平的影響。 除此之外，本病發生是否還受其他基因的影響或調控，則有待進一步深入研究。