CD24和Lgr5在結(jié)直腸息肉與結(jié)直腸癌中的表達分析

李宗壽，龐家武，江文明，何耀海

（防城港市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科，廣西防城港 538021）

結(jié)直腸癌屬于臨床消化道常見的一種惡性腫瘤，主要指腹部結(jié)腸及直腸部位組織發(fā)生癌變，其以大便帶黏液及血、大便次數(shù)增多為主要臨床表現(xiàn)。隨著腫瘤體積增大腸道逐漸變得狹窄，進而可引發(fā)腸梗阻癥狀（如腹痛、腹脹、排氣困難等），威脅患者生命安全。結(jié)直腸息肉與結(jié)直腸癌疾病發(fā)生、發(fā)展存在密切聯(lián)系[1]。相關(guān)報道指出，臨床結(jié)直腸息肉患者行切除術(shù)后其結(jié)直腸發(fā)生癌變的概率顯著降低[2]。目前臨床上對結(jié)直腸息肉和結(jié)直腸癌的診斷多依靠與腫瘤干細胞相關(guān)的表面標志物，其中CD24和G蛋白偶聯(lián)受體（Lgr5）Lgr5具有顯著的指導作用，CD24是一種黏附分子，在許多腫瘤標本中均有高表達情況，其與腫瘤細胞的浸潤、增殖存在顯著聯(lián)系；Lgr5在水平波動時可提示細胞過度增殖、分化，對腫瘤的形成發(fā)揮重要作用[3]。故本研究針對防城港市第一人民醫(yī)院行腸鏡活檢的患者標本中CD24和Lgr5的表達情況進行分析，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年1月至2020年4月防城港市第一人民醫(yī)院收治的120例結(jié)直腸息肉與結(jié)直腸癌患者作為研究對象，其中炎性增生型息肉30例，管狀腺瘤型息肉30例，絨毛性腺瘤性息肉30例，結(jié)直腸癌30例，另選取20例腸鏡檢查顯示正常黏膜者作為對照。息肉患者中直徑＜1.0 cm的43例，1.0～2.0 cm的33例，＞2.0 cm的14例；息肉無異型增生31例；低級別上皮內(nèi)瘤變30例，高級別上皮內(nèi)瘤變29例，癌變30例。診斷標準：參照《臨床診療指南：外科學分冊》[4]中關(guān)于結(jié)直腸息肉與結(jié)直腸癌的相關(guān)診斷標準。納入標準：符合上述診斷標準者，且患者均行病理組織活檢分別確診為結(jié)直腸息肉（炎性增生型、絨毛性腺瘤型、管狀腺瘤型息肉）及結(jié)直腸癌；結(jié)直腸息肉患者存在便血、腹痛等表現(xiàn)，結(jié)腸鏡檢查觀察到凸起樣病灶。結(jié)直腸癌患者腹部可觸及質(zhì)硬、表面欠光滑、活動度不大的包塊，大便潛血呈陽性，結(jié)腸鏡可觀察到腫瘤浸潤深度及周圍淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，血清癌胚抗原水平異常。排除標準：標本質(zhì)量不合格者；遺傳性結(jié)直腸癌者。此項研究經(jīng)院內(nèi)醫(yī)學倫理委員會審核批準，患者或家屬簽署知情同意書。

1.2 方法 ①標本固定使用10%中性甲醛溶液，普通石蠟進行包埋。②免疫組化染色：先進行預實驗，即依據(jù)染色效果明確Lgr5第一抗體最佳濃度在1∶100，CD24第一抗體最佳濃度應(yīng)當在1∶200，使用已知陽性片作為陽性對照，將磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作為空白對照。具體實施步驟為①脫蠟、脫水處理：將石蠟切片依次放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各10 min，隨后分別置于無水乙醇、95%乙醇以及75%乙醇中各浸泡5 min，再放入PBS中浸泡10 min；②將內(nèi)源性過氧化物酶活性去除：使用3% H2O2溶液浸泡切片10 min后再用PBS進行沖洗3次，5 min/次；③抗原修復：切片置于檸檬酸鈉緩沖液（SSC）容器（pH值為6.0）內(nèi)借助700 W微波加熱10 min使抗原修復，冷卻至室溫后再用PBS沖洗3次，5 min/次；④加一抗：分別滴加Lgr5與CD24的抗體，置于冰箱內(nèi)（4 ℃）進行24 h孵育后再放入溫箱（37 ℃）15 min復溫，采用PBS進行3次沖洗，5 min/次；⑤加二抗：方法與加一抗操作一致；⑥二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色：顯色比例為1∶50，醫(yī)師于鏡下觀察染色程度，確認染色滿意后進行封片；⑦蘇木素復染細胞核：逆梯度酒精脫水、二甲苯透明，再使用中性樹膠進行封片，最后借助顯微鏡進行結(jié)果觀察并攝片。

1.3 觀察指標 ①Lgr5及CD24陰性與陽性表達情況，借助顯微鏡對組織切片顯色反應(yīng)進行觀察，高倍鏡下（×200）每張切片隨機選擇5個視野觀察并計數(shù)。染色強度評估：0分為沒有染色；1分為輕度染色；2分為中度染色；3分為強度染色。染色細胞面積定量計分：0分為未見細胞染色；1分為細胞被染色占比＜25%；2分為細胞被染色占比25%～50%；3分為細胞被染色占比＞50%。兩種計分相乘得出檢測總結(jié)果，若總分在2分以上則提示結(jié)果為陽性，2分以下為陰性。②分析Lgr5在各種結(jié)直腸疾病中表達情況。③分析Lgr5在各種結(jié)直腸疾病中表達情況。④分析CD24在各種結(jié)直腸疾病中表達情況。⑤分析Lgr5及CD24表達與結(jié)直腸息肉異型增生的相關(guān)性。⑥分析結(jié)直腸息肉患者Lgr5陽性表達分布情況。⑦分析結(jié)直腸息肉患者CD24陽性表達分布情況。

1.4 統(tǒng)計學分析 應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件分析處理文中數(shù)據(jù)，計數(shù)資料以[例(%)]表示，行χ2檢驗，多組間計數(shù)資料采用χ2趨勢檢驗。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Lgr5及CD24陰性與陽性表達情況 提取正常黏膜、炎性息肉及結(jié)腸腺癌標本各1例，其中正常黏膜組織中未見Lgr5表達，見圖1；炎性息肉組織Lgr5有輕微表達，見圖2；Lgr5的表達主要定位于細胞質(zhì)中，以胞質(zhì)呈紅色或紫色為陽性染色，在腺癌組織內(nèi)表現(xiàn)為強陽性，見圖3；正常黏膜組織及炎性息肉組織中未見CD24表達，見圖4、圖5；CD24的表達主要定位于細胞膜，陽性反應(yīng)為細胞膜黃色或棕黃色，在腺癌組織內(nèi)表現(xiàn)為強陽性，見圖6。

圖1 Lgr5在正常黏膜中的表達（×200）

圖2 Lgr5在炎性息肉中的表達（×400）

圖3 Lgr5在結(jié)直腸癌中的表達（×200）

圖4 CD24在正常黏膜中的表達（×200）

圖5 CD24在炎性息肉中的表達（×400）

圖6 CD24在結(jié)直腸癌中的表達（×200）

2.2 Lgr5在各種結(jié)直腸疾病中表達情況 Lgr5在管狀腺瘤型、絨毛性腺瘤型息肉組及結(jié)直腸癌中的表達陽性率均顯著高于在正常黏膜及炎性增生型息肉中的表達陽性率，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表1。

表1 Lgr5在各種結(jié)直腸疾病中表達情況

2.3 CD24在各種結(jié)直腸疾病中表達情況 CD24在管狀腺瘤型、絨毛性腺瘤型息肉及結(jié)直腸癌中的表達陽性率均顯著高于在正常黏膜及炎性增生型息肉中的表達陽性率，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表2。

表2 CD24在各種結(jié)直腸疾病中的表達情況

2.4 Lgr5及CD24表達與結(jié)直腸息肉異型增生的相關(guān)性 CD24、Lgr5在低級別上皮內(nèi)瘤變、高級別上皮內(nèi)瘤變、結(jié)直腸癌患者中的表達陽性率均顯著高于無異型增生，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表3。

表3 Lgr5及CD24表達與結(jié)直腸息肉異型增生的相關(guān)性[例(%)]

2.5 結(jié)直腸息肉患者Lgr5陽性表達分布情況 高分化組及中分化患者Lgr5表達陽性率顯著低于低分化；40歲 ～ 60歲及 ＞60歲患者的CD24表達陽性率顯著高于 ＜40歲；Lgr5在＞2.0 cm及1.0～2.0 cm組表達陽性率顯著高于＜1.0 cm，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表4。

表4 結(jié)直腸息肉患者Lgr5陽性表達分布情況

2.6 結(jié)直腸息肉患者CD24陽性表達分布情況 高分化及中分化患者的CD24表達陽性率顯著低于低分化；40歲 ～ 60歲及 ＞60歲患者的CD24表達陽性率顯著高于 ＜40歲；CD24在息肉 ＞2.0 cm及1.0～2.0 cm患者中的表達陽性率顯著高于＜1.0 cm，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表5。

表5 結(jié)直腸息肉患者CD24陽性表達分布情況

3 討論

腫瘤干細胞在機體癌變過程中發(fā)揮重要作用，能夠促進惡性腫瘤組織的形成、轉(zhuǎn)移，同時也屬于癌癥復發(fā)與腫瘤耐藥等方面的根本原因[5-6]。腫瘤干細胞可以借助特異性表面標志實施分離純化，其中常見標志物主要包括CD24、CD44、CD133、CD166、Lgr5以及EpCAM等，通過對這些腫瘤干細胞特異性表面標志物表達水平進行測定，一定程度上能夠判定患者結(jié)直腸部位是否癌變，早期給予明確診斷并實施針對性治療措施，以促進預后改善[7-8]。

CD24屬于低分子量高度糖基化的黏蛋白樣的黏附分子，其可借助糖基磷脂酰肌醇而在細胞膜糖脂富集區(qū)域進行錨定；有研究指出，CD24高表達與腫瘤惡性傾向存在密切聯(lián)系，容易對患者疾病預后產(chǎn)生不良影響[9-10]。Lgr5作為糖蛋白激素類受體，可以跨越細胞膜，最早發(fā)現(xiàn)其在骨骼肌、胎盤、腦組織及脊髓中均有表達，可對胎盤組織分化與生長起到控制作用[11-12]。有研究指出，CD24及Lgr5在結(jié)直腸絨毛性腺瘤型息肉及腺癌組均呈高表達，二者可作為結(jié)直腸息肉惡變的重要參考指標以明確結(jié)直腸癌的診斷，與本文結(jié)果基本相符[13-14]。本研究中，Lgr5及CD24在管狀腺瘤型、絨毛性腺瘤型息肉及結(jié)直腸癌中陽性率均顯著高于正常黏膜組及炎性增生型組，充分說明CD24參與結(jié)直腸癌多級癌變演進的早期階段，在腫瘤細胞生長調(diào)節(jié)、增殖、侵襲與淋巴結(jié)發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮重要作用；而Lgr5在肝癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌及基底細胞癌中均具有高表達。有相關(guān)指南提出，大腸癌變主要篩查40歲以上群體，其認為＞40歲屬于息肉癌變的高危因素[15-16]。本研究中，40歲 ～ 60歲及 ＞60歲群體的CD24陽性率顯著高于 ＜40歲組，充分證實上述結(jié)論。高分化組及中分化組結(jié)腸癌患者Lgr5及CD24表達率顯著高于低分化結(jié)腸癌患者，說明Lgr5及CD24陽性表達越高，患者惡性程度越高。

綜上，Lgr5及CD24表達率在正常黏膜、炎性增生型息肉、管狀腺瘤型息肉、絨毛性腺瘤型息肉及結(jié)直腸癌中陽性表達率呈遞增式升高；Lgr5及CD24陽性率也隨著息肉直徑的增大而上升；結(jié)直腸癌患者Lgr5及CD24表達率隨著分化程度升高而上升；CD24表達與患者年齡呈正相關(guān)，Lgr5與年齡無關(guān)，二者陽性表達均與性別不相關(guān)。Lgr5及CD24可作為結(jié)直腸性息肉惡變的依據(jù)。同時，兩者高表達對結(jié)直腸癌的診斷具有較高的指導作用。