葛根素對(duì)鎘致大鼠腎臟病理變化和皮質(zhì)氧化損傷的保護(hù)效應(yīng)

徐明暢，聞雙全，王莉，張文華，鄒輝，顧建紅，劉學(xué)忠，卞建春，劉宗平，袁燕*

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.江蘇高校動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009)

鎘(cadmium, Cd)為一種重金屬元素，鎘對(duì)動(dòng)物及人體危害較大，可引起呼吸系統(tǒng)、骨骼、泌尿系統(tǒng)、血液循環(huán)系統(tǒng)等的嚴(yán)重?fù)p傷。20世紀(jì)40年代以來(lái)，鎘隨著其他金屬的開(kāi)采而釋放進(jìn)入環(huán)境中，工業(yè)的發(fā)展也使鎘的排放量愈發(fā)增加[1]。直至現(xiàn)在，重金屬鎘在大氣、飲水、土壤等環(huán)境中的蓄積量劇增，加之其生物蓄積性強(qiáng)、蓄積時(shí)間持久的特性，導(dǎo)致鎘對(duì)人體及動(dòng)物體的危害已成為令人棘手的問(wèn)題。鎘對(duì)人畜機(jī)體的危害可通過(guò)其對(duì)各組織臟器的損傷來(lái)實(shí)現(xiàn)，其中包括對(duì)肝、腎、腦、睪丸、骨骼等的損傷作用。鎘進(jìn)入機(jī)體后迅速分布于各組織臟器，其中絕大多數(shù)進(jìn)入肝臟和腎臟[2]。腎臟是鎘慢性毒性的靶器官，鎘在腎臟中的半衰期最多能達(dá)到30年[3]。鎘能造成近端腎小管和腎小球的損傷，使其對(duì)尿液的重吸收下降，引起低分子量蛋白尿癥、氨基酸尿癥、碳酸氫鹽尿癥、糖尿病等[3]。體外試驗(yàn)表明，鎘致使腎小管上皮細(xì)胞活性氧(ROS)水平升高，在體內(nèi)大量聚積從而造成氧化損傷[4]。

葛根素(puerarin, Pur)又稱葛根黃素，為一種單體化合物，化學(xué)名為4,7-二羥基8-β-D吡喃葡萄糖醛基異黃酮，相對(duì)分子質(zhì)量416。葛根素的藥理學(xué)應(yīng)用包括抵抗心律失常、降血壓、舒張血管、增加腦血流量、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、改善血脂水平、治療糖尿病、降低眼壓和解酒等[5]。葛根素對(duì)腎臟具有保護(hù)效應(yīng)，這體現(xiàn)在能降低過(guò)高的血糖[6]，改善腎小球?yàn)V過(guò)功能和代謝紊亂等[7]。目前有研究指出葛根素能降低鎘致腎上皮細(xì)胞和血清中的ROS升高，并提高機(jī)體抗氧化能力、減少腎臟內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的生成與蓄積，保護(hù)腎臟免受過(guò)氧化損傷[8]。然而，葛根素對(duì)于鎘造成的腎臟損傷的作用尚未闡明。因此，本試驗(yàn)旨在通過(guò)體內(nèi)試驗(yàn)，研究鎘暴露對(duì)大鼠腎臟的毒性損傷作用和葛根素的保護(hù)效應(yīng)，為臨床上葛根素防治鎘暴露引起的腎臟損傷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠36只，體重(70±5)g，由江蘇大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供。

1.2 主要試劑

葛根素(Sigma, USA)；醋酸鎘(CdAc2, 國(guó)產(chǎn)分析純)；羧甲基纖維素鈉(索萊寶科技有限公司)；丙二醛(MDA)、還原性谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、過(guò)氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；BCA蛋白質(zhì)量濃度測(cè)定試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)；標(biāo)準(zhǔn)蛋白(新賽美生物科技有限公司)。

1.3 動(dòng)物分組與處理

將36只SD雄性大鼠于安靜清潔干燥的室溫(22±2)℃環(huán)境中預(yù)飼養(yǎng)21 d，預(yù)飼養(yǎng)后稱重并將其隨機(jī)分為4組，分別為對(duì)照組(Con)、鎘組(Cd)、葛根素組(Pur)、鎘與葛根素共處理組(Cd+Pur)。葛根素組、鎘與葛根素共處理組每天灌胃葛根素200 mg/kg體重(用0.5%羧甲基纖維素鈉溶解)，其他組灌胃相同劑量的0.5%羧甲基纖維素鈉，灌胃14 d后，在灌胃的同時(shí)，鎘組、鎘與葛根素共處理組用50 mg/L鎘自由飲水。處理90 d后，稱重，每只大鼠按60 mg/kg體重的劑量肌肉注射戊巴比妥鈉麻醉，斷頸處死大鼠，分離完整腎臟。腎臟分離背膜，從腎臟剝離出皮質(zhì)并剪碎，放入凍存管中，置-80 ℃冰箱，待用。

1.4 病理切片制作與HE染色

將分離的完整腎臟在固定液中浸泡24 h，取出后用手術(shù)刀進(jìn)行切割，使用脫水機(jī)梯度酒精脫水、二甲苯透明，石蠟浸泡并包埋。用切片機(jī)切片后滴加30%酒精，后移入40 ℃恒溫水浴使其完全展開(kāi)，再貼附于載玻片上，并經(jīng)烤片機(jī)烘干。經(jīng)二甲苯脫蠟、蒸餾水漂洗后，分別用蘇木素染色、鹽酸酒精分色、自來(lái)水沖洗、氨水返藍(lán)、伊紅染色、酒精脫色脫水、二甲苯透明，最后用中性樹(shù)膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察(日本尼康公司)。

1.5 測(cè)定氧化損傷相關(guān)指標(biāo)

測(cè)定腎臟皮質(zhì)內(nèi)GSH、MDA含量和GSH-Px、SOD、CAT活性，根據(jù)南京建成生物工程研究所檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.6 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用數(shù)據(jù)分析軟件SPSS 24.0對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行顯著性t檢驗(yàn)和單因素方差(ANOVA)統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 腎臟病理組織學(xué)觀察

對(duì)照組(圖1A)和葛根素組(圖1B)大鼠腎組織染色均勻，腎小球形態(tài)結(jié)構(gòu)未見(jiàn)明顯異常；鎘組(圖1C)大鼠腎組織可見(jiàn)較多腎小管上皮細(xì)胞顆粒變性(黑色箭頭)，胞質(zhì)疏松淡染，可見(jiàn)刷狀緣脫落(藍(lán)色箭頭)，少數(shù)血管周?chē)梢?jiàn)較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(紅色箭頭)；與鎘組相比，鎘與葛根素共處理組(圖1D)病變有所減輕，腎小球形態(tài)結(jié)構(gòu)未見(jiàn)明顯異常，局部可見(jiàn)少量腎小管上皮細(xì)胞顆粒變性(黑色箭頭)、胞質(zhì)疏松淡染、刷狀緣脫落(藍(lán)色箭頭)。

A. Con組；B. Pur組；C. Cd組；D. (Cd+Pur)組

2.2 鎘與葛根素對(duì)大鼠腎臟皮質(zhì)內(nèi)MDA含量的影響

如圖2所示，與對(duì)照組相比，鎘組腎皮質(zhì)中MDA含量極顯著升高(P<0.01)；與鎘組相比，鎘與葛根素共處理組MDA含量極顯著降低(P<0.01)；對(duì)照組、葛根素組與共處理組之間MDA含量無(wú)顯著差異(P>0.05)。

2.3 鎘與葛根素對(duì)大鼠腎臟皮質(zhì)內(nèi)SOD活性的影響

如圖3所示，與對(duì)照組相比，鎘組腎皮質(zhì)SOD活性顯著降低(P<0.05)；與鎘組相比，鎘與葛根素共處理組SOD活性顯著升高(P<0.05)；對(duì)照組、葛根素組與共處理組之間SOD活性無(wú)顯著差異(P>0.05)。

注：大寫(xiě)字母不同表示差異極顯著(P<0.01)，小寫(xiě)字母不同表示差異顯著(P<0.05)，字母相同表示差異不顯著(P>0.05)。下同

圖3 大鼠腎皮質(zhì)中SOD活性變化

2.4 鎘與葛根素對(duì)大鼠腎臟皮質(zhì)內(nèi)CAT活性的影響

如圖4所示，與對(duì)照組相比，鎘組腎皮質(zhì)中CAT活性顯著降低(P<0.05)；與鎘組相比，鎘與葛根素共處理組CAT活性顯著升高(P<0.05)；對(duì)照組、葛根素組與共處理組之間CAT活性無(wú)顯著差異(P>0.05)。

圖4 大鼠腎皮質(zhì)中CAT活性變化

2.5 鎘與葛根素對(duì)大鼠腎臟皮質(zhì)內(nèi)GSH-Px活性的影響

如圖5所示，與對(duì)照組相比，鎘組腎皮質(zhì)中GSH-Px活性極顯著降低(P<0.01)；與鎘組相比，鎘與葛根素共處理組GSH-Px活性極顯著升高(P<0.01)；對(duì)照組、葛根素組與共處理組之間GSH-Px活性無(wú)顯著差異(P>0.05)。

圖5 大鼠腎皮質(zhì)中GSH-Px活性變化

2.6 鎘與葛根素對(duì)大鼠腎臟皮質(zhì)內(nèi)GSH含量的影響

如圖6所示，與對(duì)照組相比，鎘組腎皮質(zhì)中GSH含量極顯著升高(P<0.01)；與鎘組相比，鎘與葛根素共處理組GSH含量顯著降低(P<0.05)；對(duì)照組、葛根素組與共處理組之間GSH含量無(wú)顯著差異(P>0.05)。

圖6 大鼠腎皮質(zhì)中GSH含量變化

3 討論

鎘為環(huán)境中常見(jiàn)的重金屬之一，可造成環(huán)境的污染，并進(jìn)一步引起動(dòng)物和人的健康問(wèn)題。鎘對(duì)各組織器官均有不同程度的毒性作用，其中，腎臟可能為最敏感和重要的器官之一[9]。為了模擬“環(huán)境暴露”與“職業(yè)暴露”的鎘污染狀況，有學(xué)者分別以5 mg/L 和50 mg/L鎘飲水濃度建立了大鼠模型[10-11]。此外，研究表明50 mg/L鎘自由飲水能造成大鼠大腦、肝臟、睪丸等部位的毒性損傷[12-14]。因此本試驗(yàn)選用50 mg/L鎘自由飲水的方式探究鎘對(duì)腎臟的毒性損傷作用。本試驗(yàn)中腎臟病理切片結(jié)果顯示，鎘組部分腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)顆粒變性，胞質(zhì)疏松淡染，核淡染，微絨毛圍成的刷狀緣部分脫落，少數(shù)血管周?chē)梢?jiàn)多種炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，說(shuō)明重金屬鎘造成了腎臟一定程度的病理?yè)p傷。

氧化應(yīng)激為鎘腎臟毒性的重要機(jī)制之一，且為鎘致腎臟損傷的主要原因[15]。脂質(zhì)過(guò)氧化為氧化應(yīng)激產(chǎn)生的活性氧自由基與生物膜上的多不飽和脂肪酸發(fā)生氧化反應(yīng)，生成具有毒性的過(guò)氧化物的過(guò)程，其產(chǎn)生的二級(jí)產(chǎn)物包含多種醛酸，MDA包括在內(nèi)，且為整個(gè)過(guò)程中致突變性最強(qiáng)的一個(gè)[16]，故為氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程的重要生物標(biāo)志。本試驗(yàn)中，鎘組MDA相比于對(duì)照組，含量極顯著升高，表明鎘造成了腎臟皮質(zhì)的氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過(guò)氧化。

葛根素為一種由豆科植物野葛、甘葛的根中提取出來(lái)的中藥材，中醫(yī)認(rèn)為其有升陽(yáng)、活血、通絡(luò)的作用，因此對(duì)人體心腦血管系統(tǒng)有很多積極影響。葛根素藥理作用強(qiáng)、安全范圍廣，現(xiàn)已在臨床被廣泛運(yùn)用，包括在糖尿病早期降低疾病對(duì)腎功能的損害[26]。研究表明，200 mg/kg葛根素能有效逆轉(zhuǎn)各種原因?qū)е碌拇笫蟾髋K器病理?yè)p傷[27-28]，因此本研究選用此劑量用以探究葛根素對(duì)鎘造成腎臟毒性損傷的保護(hù)作用。本研究的病理切片結(jié)果顯示，葛根素緩解了鎘造成的腎臟病理?yè)p傷：腎上皮細(xì)胞見(jiàn)有少量顆粒變性，刷狀緣脫落程度不大，未見(jiàn)明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。許多研究發(fā)現(xiàn)葛根素能降低不同原因所致的腎臟氧化損傷，如鋁造成的脂質(zhì)過(guò)氧化作用[29]、腎臟組織細(xì)胞缺血再灌注引起的氧化應(yīng)激[30]等。龍夢(mèng)菲等[8]研究發(fā)現(xiàn)葛根素能降低鎘造成的血清中MDA含量的升高和SOD、總抗氧化能力(T-AOC)活性的下降。本研究發(fā)現(xiàn)，葛根素能抑制鎘引起的腎皮質(zhì)中MDA、GSH含量升高，GSH-Px、SOD和CAT活性降低，說(shuō)明天然抗氧化劑葛根素能在一定程度上減輕重金屬鎘對(duì)腎臟造成的氧化應(yīng)激，提高機(jī)體的抗應(yīng)激水平。

綜上，本研究表明，鎘暴露能導(dǎo)致腎臟發(fā)生一定的病理變化，并能引起腎皮質(zhì)中MDA、GSH含量升高，SOD、CAT和 GSH-Px活性降低，導(dǎo)致腎臟氧化損傷；葛根素對(duì)鎘造成的腎臟毒性具有一定的保護(hù)作用。