祛風解痙方對哮喘模型小鼠γδT淋巴細胞表達的影響

樊長征 苗青 洪巧瑜 崔云 何沂 張瓊 張文江

摘要 目的：探討祛風解痙方對哮喘模型小鼠γδT淋巴細胞表達的影響。方法：以卵清蛋白滴鼻的方法建立哮喘Balb/c小鼠模型。動物分組：將30只小鼠隨機分為正常組、模型組、醋酸潑尼松片組（0.27 mg/d）及3個祛風解痙方組（0.59、1.18、2.36 g/d），分別進行干預，給藥14 d，1次/d。結果：與哮喘模型組比較，祛風解痙方低劑量組的γδT細胞的細胞活性差異無統計學意義（P>0.05），而祛風解痙方中劑量組、祛風解痙方高劑量組及陽性藥物組的γδT細胞的細胞活性顯著降低（P<0.05）。與模型對照組比較，祛風解痙方低劑量組的IL-5、IL-13、TGF-β、IL-10、IFN-γ水平差異無統計學意義，而祛風解痙方中劑量組、高劑量組以及醋酸潑尼松片組在治療后IL-5、IL-13、TGF-β的表達均顯著降低（P<0.05），IL-10、IFN-γ的表達均顯著升高（P<0.05）。結論：祛風解痙方通過抑制γδT細胞的細胞活性，降低γδT細胞分泌的細胞因子IL-5、IL-13、TGF-β表達，調高IL-10、IFN-γ的表達抑制氣道炎性反應，改善哮喘小鼠的氣道高反應性。

關鍵詞 祛風解痙方藥;哮喘;γδT淋巴細胞;細胞因子;細胞活性;氣道高反應性;氣道炎性反應;中醫藥治療

Effects of Qufeng Jiejing Formula on the Expression of γδt Lymphocyte in Asthmatic Model Mice

FAN Changzheng1，MAO Qing1，HONG Qiaoyu2，CUI Yun1，HE Yi1，ZHANG Qiong1，ZHANG Wenjing1

（1 Department of Respiration，Xiyuan Hospital of China Academy of Chinese Medical Science，Beijing 100091，China;

2 Department of Traditional Chinese Medicine，Beijing Health Vocational College，Beijing 101101，China）

Abstract Objective：To investigate the effects of Qufeng Jiejing Formula on the expression of γδT lymphocyte in asthmatic model mice.Methods：The asthmatic Balb/c mice model was established by ovalbumin nasal drops.Animal grouping：a total of 30 experimental mice were randomly divided into a normal group，a model group，a prednisone acetate tablet group（0.27 mg/d）and a 3 Qufeng Jiejing Formula groups（0.59，1.18，2.36 g/d）.The mice were given intervention for 14 days，once a day.Results：Compared with the asthma model group，there was no significant difference in the cell activity of γδT cells in the low-dose Qufeng Jiejing Decoction group（P>0.05），while the middle-dose Qufeng Jiejing Decoction group and the high-dose Qufeng Jiejing Decoction group and the cell viability of γδT cells in the positive drug group was significantly reduced（P<0.05）.Compared with the model control group，the levels of IL-5，IL-13，TGF-β，IL-10 and IFN-γ in the low-dose group of Qufeng Jiejing Formula had no significant difference，while the levels of IL-5，IL-13 and TGF-β in the middle-dose group，the high-dose group and the prednisone acetate tablet group decreased significantly after treatment（P<0.05），while the levels of IL-10 and IFN-γ increased significantly（P<0.05）.Conclusion：Qufeng Jiejing Formula can by inhibiting the cell activity of γδ T cells，reduce the expression of cytokines IL-5，IL-13，and TGF-β secreted by γδ T cells，increase the expression of IL-10 and IFN-γ，inhibit airway inflammation，and improve asthmatic mice

Keywords Qufeng Jiejing Formula; Asthma; γδT lymphocyte; Cytokines;Cytoactive; Airway hyperresponsiveness; Airway inflammation; TCM treatment

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.02.012

支氣管哮喘（以下稱哮喘）主要特點表現為慢性氣道炎性反應及氣道高反應性，其發生發展的關鍵為Th1/Th2失衡，眾多細胞和因子影響著Th1/Th2平衡，其中γδT細胞表達變化影響著Th1/Th2應答平衡，與哮喘發生發展密切相關，因此研究γδT細胞表達變化受到越來越多重視[1-3]。

根據受體不同，T細胞分為αβT細胞和γδT細胞，αβT細胞在外周血中約>90%，γδT細胞主要存在黏膜上皮及表皮組織中，約10%～50%[4]，γδT細胞在黏膜上皮及表皮中大量表達，表明其在黏膜免疫調節及防御中發揮著重要作用[5]，γδT細胞功能的參與和執行者主要為Th1型IL-2、IFN-γ、TNF-α及Th2型IL-6、IL-4等細胞因子[6-7]。根據δ鏈的不同，人γδT細胞分為δ1和δ2 2個亞群，根據γ鏈不同，分為Vγ1、Vγ4、Vγ5、Vγ6亞群。前期研究表明卵清蛋白（OVA）致敏的小鼠哮喘模型中，Vγ1+γδT細胞亞群增強了哮喘小鼠氣道高反應性[8]，同時Vγ1+γδT細胞可降低IL-10和TGF-β的表達減輕哮喘小鼠氣道炎性反應[9]，研究也表明Vγ4+γδT細胞下調Th2型應答，降低哮喘小鼠氣道高反應性[10-11]，因此，哮喘發生發展的主要細胞群為Vγ1γδT和Vγ4γδT細胞。

中醫學者在臨床中發現“風盛”是哮病發病的主要因素之一，認為“風盛痰阻，氣道攣急”既是哮喘發作的病因又是其發病之結果，“風盛痰阻，氣道攣急”貫穿于哮喘的發作期、緩解期、穩定期，這與哮喘氣道高反應性高度一致，與氣道高反應密切相關。基于此本課題組進行動物實驗，探索了祛風解痙方藥對哮喘小鼠γδT淋巴細胞的影響[7]，現匯報如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 6～8周齡雄性Balb/c小鼠，動物體質量（35.0±3.0）g左右，清潔級，溫度18～22 ℃，濕度50%～60%，光照12 h/12 h，購自湖北省動物實驗中心（生產許可證：31162040001417），動物合格證號SYXK（鄂）2013-0069。

1.1.2 藥物 祛風解痙方：炙麻黃9 g、杏仁10 g、防風10 g、地龍12 g、蟬蛻10 g、柴胡9 g、蒼耳子6 g、烏梅6 g、陳皮10 g、半夏9 g、茯苓12 g、甘草6 g（中國中醫科學院西苑醫院中藥房）;醋酸潑尼松片（天津力生制藥股份有限公司，批號：1709111）。

1.1.3 試劑與儀器 卵清蛋白（OVA）（Sigma，美國，貨號：A5503-1G）;氫氧化鋁（Al（OH）3（Sigma，美國，貨號：V900163-500G）;蘇木素（福州邁新生物，貨號：CTS-1099）;伊紅（北京索萊寶，貨號：G1100）;唑來膦酸（上海Aladdin，Z129382）;CCK8反應液（上海碧云天，貨號：C0038）;IL-2（北京Solarbio，貨號：P00198）;IL-5（聯科生物，美國，貨號：EK2051）;IL-13（聯科生物，美國，貨號：EK2131/2）;IL-10（聯科生物，美國，貨號：EK2101/2）;TGF-β（博士德生物，美國，貨號：EK0515）;IFN-γ（聯科生物，美國，貨號：EK2801/2）;酶標儀（Multiskan MK3，美國，型號：Thermo Scientific）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 按照隨機數字表將30只小鼠分為6組;空白對照組（不造模，給予等體積生理鹽水，灌服，n=5）;模型組對照組（造模后，給予等體積生理鹽水，灌服，n=5）;模型組對照組（造模后，給予等體積生理鹽水，灌服，n=5）;祛風解痙方低劑量組（造模后，給予1倍劑量中藥，0.59 g/d，灌服，n=5）;祛風解痙方中劑量組（造模后，給予2倍劑量中藥，1.18 g/d，灌服，n=5）;祛風解痙方高劑量組（造模后，給予4倍劑量中藥，2.36 g/d，灌服，n=5）;陽性對照組（造模后，給予1倍劑量醋酸潑尼松片，0.27 mg/d，灌服，n=5）。在無菌環境中飼養適應1周后，進行第一次致敏，腹腔內注射20 μg OVA和2 mg Al（OH）3;第2、3周后進行第2、3次致敏，腹腔內注射10 μg OVA和1 mg Al（OH）3;第5周開始每天用等量的PBS配制的5%OVA 40～50 min滴鼻處理。正常對照組用生理鹽水致敏，滴鼻處理用等量的PBS，連續7 d后評估模型是否成功。

1.2.2 給藥方法 祛風解痙方按人體每日用藥量的1倍，2倍，4倍劑量給藥。醋酸潑尼松片（5 mg/片），成年10片/d，給藥量按照人與小鼠體表面積換算方式計算，按人體每天用藥量的1倍量給藥。模型建立后，第2天開始灌胃給藥干預，飼料正常給予。給藥14 d。

1.2.3 檢測指標與方法 肺氣道組織γδT細胞的分離純化及擴增：小鼠麻醉處死后，將各組小鼠肺組織用無菌手術刀取出，切碎并用collgenase消化得到的細胞，用抗TCRγδ磁珠分選γδ T細胞及檢測其濃度。分離純化的γδ T細胞加入50 mL培養瓶中，加入含10%血清濃度為100 U/mL雙抗RPMI-1640培養基3 mL，再加IL-2（終濃度為200 IU/mL）、唑來膦酸（終濃度為300 pg/mL），置于CO2濃度為5%，溫度為37 ℃恒溫箱中培養，培養9～12 d，其中每3 d換1次液，調整細胞濃度為106個/mL。CCK-8檢測γδT細胞的增殖活性：對各組小鼠肺組織通過分選得到γδT細胞，取擴增10天細胞，CCK-8檢測分選純化后γδT細胞的增殖活性。接種培養10 d的各組肺氣道組織γδT細胞，向每孔加入CCK8反應液10 μL，接著將培養板置于37 ℃，5% CO2條件下培養箱內孵育4 h。然后用酶標儀測定在450 nm處的吸光度。ELISA法測定γδT細胞：分泌的細胞因子濃度按照各指標試劑盒說明書（IL-5、IL-13、IL-10、TGF-β、EK0515、IFN-γ）的操作步驟進行標準品的稀釋和加樣。將測樣品50 μL加入酶標包被板上待測樣品孔中。將樣品加于酶標板孔底部后晃動混勻，晃動時不要觸及孔壁。封板后放置于溫度為37 ℃的溫箱中溫育30 min。溫育30 min后揭掉封板膜去液體甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，用上面相同的方法重復5次后拍干。每孔加入酶標試劑50 μL，溫育30 min后洗滌。每孔依次入顯色劑A 50 μL、B 50 μL，小心晃動混勻，在37 ℃避光條件下顯色15 min后加終止液50 μL終止反應，當藍色立轉黃色時以空白空調零，在15 min內采用450 nm波長依序測量各孔吸光度（OD值）。

1.3 統計學方法 采用SPSS Statistics 17.0統計軟件進行數據分析，本試驗數據檢驗為方差齊，正態分布，計量數據以均數±標準差（±s）表示，做單因素ANOVA-LSD檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CCK-8檢測γδT細胞的增殖活性 與正常對照組比較，哮喘模型小鼠的γδT細胞的細胞活性顯著增強。與哮喘模型組比較，祛風解痙方低劑量組的γδT細胞的細胞活性差異無統計學意義，而祛風解痙方中劑量組、祛風解痙方高劑量組以及陽性藥物組的γδT細胞的細胞活性顯著降低。見圖1、圖2。

2.2 ELISA法測定γδT細胞分泌的細胞因子濃度? 取各組擴增10天γδT細胞，ELISA測定γδT細胞培養上清中IL-5、IL-13、IL-10、TGF-β、IFN-γ濃度。結果如圖3及表1所示，與空白對照組比較，模型對照組的IL-5、IL-13、TGF-β水平上升。與模型對照組比較，祛風解痙方低劑量組的IL-5、IL-13、TGF-β水平差異無統計學意義（P>0.05），而祛風解痙方中劑量組、祛風解痙方高劑量組以及醋酸潑尼松片組在治療后IL-5、IL-13、TGF-β的水平均顯著降低（P<0.05）。與空白對照組比較，模型對照組IL-10、IFN-γ水平降低。與模型對照組比較，治療后IL-10、IFN-γ水平上升，祛風解痙方低劑量組的IL-10、IFN-γ水平差異無統計學意義（P>0.05），而祛風解痙方中劑量組、祛風解痙方高劑量組以及醋酸潑尼松片組在治療后IL-10、IFN-γ的水平均顯著升高（P<0.05）。

3 討論

中醫學認為哮喘的主要病理機制為痰阻氣道、肺失宣降、風盛痰阻、氣道攣急等，現代醫學認為哮喘的發病機制有氣道炎性反應、變態反應、氣道高反應性和神經因素等[5]。氣道高反應性是一種反映哮喘患者氣道功能異常狀態的關鍵指標之一，在哮喘診斷及哮喘患者的病情和預后評估中具有重有意義，指氣道對刺激物的反應性增高，氣道出現支氣管平滑肌收縮、黏液分泌增多及免疫炎性遞質釋放，氣道阻力上升和肺通氣功能下降[6]。β2激動劑與糖皮質激素是控制哮喘主要的藥物，長期使用這些藥物后部分患者出現激素抵抗，療效下降，不能很好控制癥狀[12]。祛風解痙方是根據哮喘氣道高反應性的病因病機“風盛痰阻，氣道攣急”組成。炙麻黃為君，宣肺平喘。麻黃堿可松弛支氣管平滑肌，麻黃提取物對機械刺激引起的咳嗽有明顯的鎮咳效果[13]。杏仁、防風、柴胡、地龍、蟬蛻為臣藥，杏仁止咳平喘，苦杏仁苷對呼吸中樞呈抑制作用而達到鎮咳平喘效應[14]。防風有抗炎、抗菌、抗過敏等藥理作用[15]。地龍可通過其抗炎纖溶和抗組胺作用干預氣道重構的信號通路和絲裂原活化蛋白激酶通路，對氣道重構起到防治和逆轉作用[16]。蟬蛻有抗炎、鎮咳祛痰平喘、鎮靜止痛解痙、抗驚厥、抗凝等作用[17]。蒼耳子、陳皮、半夏、茯苓為佐藥，蒼耳子具有抗過敏、抑菌、抗炎、鎮痛等藥理作用[18];茯苓、陳皮、半夏健脾燥濕祛痰，與麻黃、防風、柴胡起到宣發肺氣暢通氣道之功。甘草、烏梅為使藥。甘草甘微溫，用以調和諸藥，緩麻黃燥烈之性。烏梅斂肺、生津，與柴胡、防風配伍，調和陰陽。該方藥能改善哮喘患者肺功能，降低易感性，降低呼吸道阻力，降低機體對過敏因素的應激反應，使肺小氣道變為舒張，氣道通順，能明顯緩解哮喘氣道高反應性，明顯改善哮喘氣道高反應性患者臨床癥狀，較好控制哮喘發作，改善哮喘氣道阻塞，是防治哮喘患者氣道高反性的有效方法[19]。

Lahn等[20]發現小鼠肺γδT細胞一方面下調過敏反應中的氣道高反應性，另一方面募集嗜酸粒細胞，活化B細胞和T細胞，表現出2種不同的免疫效應。γδT細胞主要是募集B細胞到過敏反應局部影響其分泌Ig類型[21]。向小鼠注射γδT細胞的單克隆抗體導致氣道高反應性-哮喘的發生[20]。因此，γδT細胞通過影響Th1/Th2應答平衡左右哮喘氣道高反應性的發生發展。支氣管哮喘還表現為氣道慢性炎性反應，T淋巴細胞在哮喘炎性反應病理過程也起關鍵調節作用。γδT細胞是T淋巴細胞的一種，有研究顯示γδT細胞具有促進氣道炎性反應的作用[22]。本研究顯示，與正常對照組比較，哮喘模型組γδT細胞的細胞活性顯著增強，表明哮喘模型鼠肺組織的炎性反應加重。祛風解痙方中劑量組、祛風解痙方高劑量組及陽性藥物組的γδT細胞的細胞活性顯著減弱，表明中藥治療和陽性藥物治療可以顯著緩解哮喘模型小鼠肺組織的炎性反應，具有一定的治療效果。

哮喘主要特點為慢性氣道炎性反應及氣道高反應性，其發生發展的關鍵為Th1/Th2失衡，眾多細胞和因子影響著Th1/Th2平衡。研究發現細胞因子IL-4、IL-5、IL-13、IL-25等高表達可引起哮喘患者氣道高反應性。IL-4和IL-13促進IgE高表達，IL-5、GM-CSF增強嗜酸性粒細胞增殖、活化、聚集，IL-13還直接增加氣道黏膜分泌，IFN-γ和TNF-β等引發細胞免疫，同時IFN-γ可抑制IL-4及下調IgE的合成。我們的研究結果表明祛風解痙方中劑量組、祛風解痙方高劑量組在治療后IL-5、IL-13、TGF-β的水平均顯著降低，而IL-10、IFN-γ的水平均顯著升高。因此，祛風解痙方可緩解哮喘模型小鼠肺組織的炎性細胞浸潤情況，且祛風解痙方高劑量組的治療效果最明顯。

綜上所述，祛風解痙方通過抑制γδT細胞的活性，降低γδT細胞分泌的細胞因子IL-5、IL-13、TGF-β表達水平，調高IL-10、IFN-γ的表達水平抑制氣道炎性反應，改善哮喘模型小鼠的氣道高反應性，其中高劑量中藥對于哮喘模型小鼠具有良好的治療效果。

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（2019-04-26收稿 責任編輯：王明）

基金項目：北京自然科學基金面上項目（7172190）——祛風解痙中藥調節γδT細胞抑制哮喘小鼠氣道高反應性的機制

作者簡介：樊長征（1979.03—），男，博士，副主任醫師，研究方向：中醫藥防治肺系疾病研究，Tel：（010）2835377，E-mail：faanchzh@163.com