重金屬溶液中微藻物質光譜變化的研究

熊 鑫，王雨田，邵詠妮

（上海理工大學 光電信息與計算機工程學院，上海 200093）

引 言

隨著城市的發展和工業產值的提高，水體中重金屬鎘（Cd）、鉛（Pb）、鎳（Ni）、銅（Cu）等[1]的含量不斷增加，對動植物以及人類健康造成越來越嚴重的威脅。人體如長期接觸鎳（Ni）會使皮膚潰爛，甚至頭發發白[2]。重金屬危害的持久性、不易降解以及隨著食物鏈的富集危害性逐漸增強的特點[3]，使得我們不得不重視水體重金屬污染的問題。

目前，水體重金屬的檢測方法主要有原子吸收分光光度計法、電感耦合等離子體原子發射光譜法等。這些方法存在預處理較耗時、成本高，且不能反映水環境中生物的受污染程度等問題。為了在監測水體的同時能夠了解水體生物受污染程度等，采用水體生物監測水環境情況已成為一個新的研究方向。

微藻作為水環境中重要的光合生物[4]，其再生性強、培養成本低并且無污染，由于具有快速吸附重金屬的能力，可以大量投放于污水中，因此是水體污染檢測的理想研究對象。Subramaniyam等利用螺旋藻有效吸附了廢水中的Pb2+[5]。

隨著光子學技術和材料科學技術的發展，太赫茲輻射技術的應用研究也迅速擴展到了越來越多的領域。太赫茲（THz）波位于遠紅外線和微波之間，頻率范圍為0.1～10 THz，既有紅外波特性，也具有微波特性。由于太赫茲輻射的光子能量較低，不會對物質產生破壞作用，因此可對待測樣品進行無損檢測。另外，相比于其他的光譜技術，太赫茲波能夠穿透大多數非極性材料，適合對生物組織進行活體檢查。很多生物樣本如脂質、蛋白質等的分子振動范圍在太赫茲范圍內，它們的太赫茲特征峰明顯[6]。在利用太赫茲技術檢測生物成分方面，Nakajima等采用太赫茲光譜（3.0～13.5 THz）對綠豆植株發芽后1～7 d內淀粉含量進行了測定，結果表明太赫茲譜可以對幼苗的不同糖類結構進行定性識別[7]。

由于斜生柵藻（亦稱為微藻）的主要成分是色素和淀粉，因此微藻對重金屬Pb2+吸附后，其體內色素和淀粉會發生改變。因此，本文采用斜生柵藻研究了其在不同重金屬質量濃度（Pb2+:0 mg/L、0.005 mg/L、 0.010 mg/L、0.020 mg/L、0.050 mg/L）的水體中物質成分的改變情況。實驗采用太赫茲、遠紅外光譜技術獲取不同質量濃度重金屬溶液中藻體的光譜信號，通過偏最小二乘法（PLS），辨別不同重金屬質量濃度下微藻樣本的差異性。

1 材料與方法

1.1 生物及化學材料來源

實驗所用的斜生柵藻（scenedesmus obliquus,株系276）購于中國科學院野生生物種質庫的淡水藻種庫。實驗所用化學試劑硝酸鉛（99%，分子量331.21）購于阿拉丁試劑網。

1.2 樣品制備

購買的斜生柵藻需經大約2個月的培養，待其生長并達到穩定。取5份等量斜生柵藻藻液，先對其進行離心，然后棄上清液，再加入等量超純水重復離心3次，并分別棄上清液，最終獲得去除雜質的藻泥。

根據實驗要求，配置5份等量的高溫高壓滅菌的BG11培養液，并分別裝于25 mL容量瓶中。將第一份藻泥置于第一個瓶子中作為對照組（標為CK），其余4份分別配置成Pb2+的質量濃度 為0.005 mg/L、0.010 mg/L、0.020 mg/L、0.050 mg/L的重金屬溶液作為實驗組，并在這4份中分別加入藻泥，同時分別貼好標簽A、B、C、D。將制備好的微藻樣品液置于超凈培養平臺上，培養條件與原培養條件一致。在每次實驗前，用細胞計數法測定微藻細胞為 3 ×106個/ m L ，以保證微藻在整個實驗過程中處于穩定的生長狀態。

1.3 傅里葉變換紅外太赫茲光譜采集

室溫下，在制備好10 min后的對照組和實驗組A、B、C、D中分別取等量藻液于離心管中，以8 000 r/min的速度離心5 min，得到約200 mg的藻泥，加入超純水重復離心3次并棄上清液，得到去除雜質的藻泥。然后，在每個裝有藻泥的離心管中添加超純水至1.5 mL處，將濃縮至1.5 mL的藻類溶液添加到20 mm × 20 mm的光滑聚苯乙烯模具中，并在25 ℃下干燥3 h，此時，將5組樣品分別制成厚度為20 μm的薄膜。實驗在真空腔內以4 c m-1的分辨率采集樣本的吸收譜。每次測量結果是64次樣品掃描和64次背景掃描的平均值，測量頻段范圍為1～20 THz。實驗有5種樣品，每種樣品準備3個平行樣本，每個平行樣本上面取兩個點，每個點處采集2個數據，所以每種樣品共計得到12個譜線數據，而后每個譜線由12個數據取平均得到。

2 結果與討論

2.1 藻體主要成分的光譜特征峰分析

現有研究表明[8-12]，純品蛋白質、淀粉和類胡蘿卜素在太赫茲及遠紅外波段有各自的特征峰位。斜生柵藻的主要成分為蛋白質、色素、淀粉等，它們具有不同的吸收譜且分布在不同的頻段。Zuo等研究發現，在10～20 THz頻帶范圍內，類胡蘿卜素有多個吸收峰，分別位于12.0 THz、14.0 THz、15.5 THz以及20.0 THz左右。在室溫下，類胡蘿卜素又有一些中等強度的太赫茲峰，如17.5 THz處[8]；另外蛋白質特征峰為3.5～5.0 THz的包絡[9]；2.3 THz、9.2～9.8 THz處為脂質的特征峰[9-11]；淀粉特征峰為9.1 THz、10.5 THz、17.3 THz處[12]。根據這些結果，我們可以通過分析水體微藻成分的光譜變化，對水體重金屬質量濃度進行研判。

2.2 Pb2+溶液中藻體傅里葉變換紅外太赫茲光譜變化

在確定微藻主要成分的特征吸收峰后，我們對本研究中在不同Pb2+溶液中吸附Pb2+后的斜生柵藻樣本進行太赫茲光譜采集及譜峰分析，得到其主要成分的變化情況。取污染水體Pb2+的質量濃度分別為0.005 mg/L、0.010 mg/L、0.020 mg/L、0.050 mg/L，用斜生柵藻對這些水體進行吸附，得到斜生柵藻吸附10 min后的各組太赫茲光譜，如圖1所示。

圖1 微藻太赫茲光譜Fig.1 Terahertz spectrum of microalgae

圖1（a）是斜生柵藻吸附重金屬Pb2+后獲得的太赫茲光譜圖。圖1（b）為圖1（a）的基線校正圖。其中，3.70 THz處形成一個大包絡，9.24 THz、10.57 THz處均有明顯的特征峰，這3處特征峰分別對應藻體內蛋白質、脂質、淀粉，同時13.75 THz、16.10 THz、19.88 THz對應為類胡蘿卜素。

為了便于分析，我們選取微藻中蛋白質及類胡蘿卜素特征峰提取出來，這些峰位吸光度隨時間的變化規律如圖2所示。由圖2（a）、（b）可知，微藻在Pb2+溶液中吸附重金屬期間，隨著Pb2+質量濃度的增加，藻體內類胡蘿卜素（依次對應13.75 THz、16.10 THz、17.28 THz、19.88 THz）和蛋白質（3.70 THz）光譜強度呈現遞減趨勢。

圖2 物質成分變化Fig.2 Changes of substance composition

當Pb2+質量濃度由0 mg/L增加至0.010 mg/L時，類胡蘿卜素下降幅度較大，依次達到2.53%、2.48%、2.63%、2.78%，蛋白質下降幅度達到2.79%。當Pb2+質量濃度由0.010 mg/L增加至0.050 mg/L時，類胡蘿卜素和蛋白質的光譜強度下降幅度趨于平緩，如圖3及表1所示。

表1 不同Pb2+質量濃度下斜生柵藻物質成分含量下降占比Tab.1 Percentage of material composition decrease in scenedesmus obliquus at different Pb2+ concentrations

圖3 不同Pb2+質量濃度下斜生柵藻物質成分下降占比Fig.3 Proportion of decline in the composition of scenedesmus obliquus at different concentrations of Pb2+

2.3 基于偏最小二乘（PLS）的不同質量濃度下的藻體樣本差異性辨別

由上述結果可知，微藻在吸附重金屬過程中其蛋白質及類胡蘿卜素的含量隨之發生了改變，其中類胡蘿卜素含量變化最為明顯。進一步地，對于每種吸附重金屬水體10 min的斜生柵藻樣本，我們將其在1～20 THz范圍內的吸光度值按照校正集與預測集2∶1的比例構建PLS模型矩陣。通過比較校正集和預測集的相關系數和均方根誤差來判定預測模型的精度。其中校正集和預測集的相關系數分別達到0.931 09、0.971 97，均方根誤差分別為0.040 41及0.037 60，結果顯示10 min內不同重金屬質量濃度下的微藻存在差異。

3 結 論

本文利用太赫茲、遠紅外光譜技術得到Pb2+溶液培養下斜生柵藻體主要成分如類胡蘿卜素、蛋白質的光譜變化。通過對比斜生柵藻主要成分對應特征峰處的吸光度值，研究類胡蘿卜素、蛋白質受Pb2+的響應。實驗結果顯示，微藻進行重金屬吸附后，隨著重金屬質量濃度的增加，斜生柵藻內類胡蘿卜素和蛋白質含量呈現下降趨勢。同時，PLS結果顯示，微藻吸附重金屬10 min后即可以對不同質量濃度的Pb2+溶液進行區別。

實驗結果表明，利用太赫茲、遠紅外光譜技術可以實現重金屬（Pb2+）的質量濃度區別，為水體受重金屬污染的實時監測提供了一種新的方法。