DLC-1、PCDH10表達水平和NQO1基因多態性與吸煙誘導胃癌ESD術后復發的關系

張敏 周曉晴 李保華 羅超 唐僑

胃癌是發病率和病死率均較高的消化道惡性腫瘤之一，其發生機制比較復雜，遺傳因素、環境飲食因素、幽門螺桿菌感染等癌前病變以及吸煙等不良生活習慣均是胃癌發生的誘因[1]。目前臨床上常采用內鏡黏膜下剝離術(endoscopic submu-cosal dissection，ESD)治療早期胃癌，該治療方法是一種微創術，具有術后恢復快以及臨床效果較佳等優勢，但研究顯示仍有部分患者會發生術后復發[2]。近來很多研究證實人體內多種基因均參與了胃癌發生發展歷程，有學者們報道DLC-1蛋白對于癌細胞生長和轉移具有明顯抑制作用[3]。編碼原鈣黏蛋白10(protocadherin-10，PCDH10)作為多種惡性腫瘤的預測標志物之一，該基因甲基化過程與胃癌進程存在緊密聯系，且PCDH10甲基化水平與腫瘤不良預后具有顯著相關性。但目前臨床上尚未完全揭示DLC-1和PCDH10表達水平對于胃癌患者預后的影響作用[4]。NQO1作為腫瘤易感基因，該基因突變會增加胃癌發生風險；而吸煙作為多種腫瘤的獨立危險因素已被證實，有研究報道吸煙與NQO1多態性存在交互作用，二者會共同促進誘導胃癌發生和進展[5]。本文將探討DLC-1、PCDH10表達水平和NQO1基因多態性與吸煙誘導胃癌ESD術后復發的關系，旨在為胃癌復發預防和控制提供參考價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性的選取2015年1月至2018年1月在四川省儀隴縣人民醫院進行ESD術的202例胃癌患者作為研究對象，其中男128例(63.37%)，女74例(36.63%)；年齡38～78歲，平均年齡(58.69±6.87)歲。根據患者患胃癌前是否吸煙分為吸煙組(n=102)和不吸煙組(n=100)。吸煙的定義標準為：每天吸煙1支及以上，吸煙時間持續半年以上。102例吸煙患者每天的人均吸煙量為(5.65±1.02)支，吸煙時間為8個月～10年，平均吸煙時間為(5.36±0.53)年。2組患者年齡、性別比、腫瘤病理學分型等一般資料差異無統計學意義(P>0.05)。根據患者行胃癌ESD術后1年內的復發情況分為復發組和未復發組(術后每3個月對患者隨訪1次，隨訪時間為1年，終點事件包括復發或死亡)。所有患者簽署知情同意書，本研究獲得我院倫理委員會批準。

1.2 納入排除標準

1.2.1 納入標準[6]：①患者均經病理切片確診為胃癌，且滿足ESD術治療適應癥并進行ESD術治療者；②未接受放化療或靶向治療者；③自愿并簽署知情同意書。

1.2.2 排除標準：①合并心腎功能不全、重度高血壓等嚴重疾病者；②患有嚴重內外科疾病或傳染病者；③既往接受過胃癌切除術或放療、化療者；④患有嚴重精神疾病者；⑤無法接受或完成隨訪者。

1.3 方法

1.3.1 臨床資料收集:全面收集所有研究對象的臨床資料，包括性別、年齡、病理類型以及臨床分期等資料。

1.3.2 DLC-1蛋白表達檢測:采用SP法檢測胃癌和癌旁組織以及正常胃組織的DLC-1表達：使用抗體及試劑盒為濃縮型DLC-1兔抗人單克隆抗體(購自GENE TEX)和DAB顯色試劑盒和SP試劑盒(購自默沙克生物)，將ESD手術過程中，于胃竇部位采集患者胃癌組織(距腫瘤中心<1 cm)、癌旁組織(距腫瘤中心<3 cm的邊緣)以及正常胃組織(距離腫瘤中心>5 cm)，石蠟包埋后制備成厚度為2 μm切片，然后使用枸櫞酸鹽緩沖液(0.01 mol/L)經過微波處理后修復抗原，于室溫下孵育DLC-1抗體30 min。結果判斷標準[7]：DLC-1免疫反應主要發生在胞質內，反應物顏色呈棕黃色。染色強度分為4級，分別為0～3分。分別代表無陽性染色(0分)、淺黃色(1分)、棕黃色(2分)、棕褐色(3分)。著色范圍分為4級(Ⅰ～Ⅳ級)：其中Ⅰ級表示無陽性細胞染色(0分)，Ⅱ級表示陽性細胞率<25%(1分)，Ⅲ級表示陽性細胞率范圍為26%～50%(2分)，Ⅳ級表示陽性細胞率>51%(3分)。在高倍鏡視野內隨機選取100個細胞，計算陽性率，連續觀察5次求平均值。染色結果=染色強度×染色：陰性(-)、陽性(+)、中度陽性(+)以及強陽性(++)分別得分為0分、1～2分、3～6分和7～9分。本文判斷總結果標準為≤2分判定為陰性，>2分判定為陽性。

1.3.3 PCDH10 RNA表達水平測定:采用TRIzol法使用總RNA提取試劑盒(購于賽默飛世爾中國公司)提取所有患者胃癌和癌旁組織中的總RNA ，使用紫外分光光度計(UV)測定提取出的總RNA濃度，樣品A260/A280≥1．80視為合格。然后采用逆轉錄試劑盒(購于賽默飛世爾中國公司)將總RNA進行逆轉錄，分別得到模板單鏈cDNA，然后使PCR試劑盒以對cDNA進行PCR。 PCR設置的PCR反應條件為：95℃ 5 min，95℃ 40 s，60℃ 20 s，72℃ 15 s；連續循環40次，然后采用2-ΔΔct分別計算PCDH10 RNA相對表達量(RQ)[8]。結果判斷標準：低表達組：≤0.5；高表達組：≥2；無顯著差異組：0.5～2。

1.3.4 NQOlC609T基因分型:引物F和R分別為：5’-TCTTACTGAGAAGCCCAGACCAACT-3’；5’-CTCCAGGCGTTTCTTCCATCC-3’。PCR反應條件：95℃ 5 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，70℃ 30 s，循環30次后70℃延伸10 min。使用PCR對DNA模板擴增后生成212 bp片段，NQO1基因CC只可見212 bp，TT和CT基因型發生C→T基因突變后分別可見83和129 bp、83、129以及212 bp 條帶，且CC基因型不存在Hinf I酶切位點，TT基因出現HinfI酶切位點。

2 結果

2.1 2組患者組織DLC-1表達情況比較 吸煙組患者DLC-1陽性表達比例顯著低于不吸煙組患者(P<0.05)。另外染色結果表明：DLC-1在正常胃組織、癌旁組織和癌組織中表達水平分別呈現高表達、中表達、低表達，免疫反應性逐漸減弱。見表1，圖1。

圖1 DLC-1在正常胃組織(A)、癌旁組織(B)和胃癌組織(C)中的免疫組織化學染色圖(×200)

2.2 2組患者血清PCDH10 mRNA表達量比較 吸煙組患者PCDH10 mRNA表達量顯著高于不吸煙組(P<0.05)，且2組患者胃癌組織PCDH10 mRNA表達量顯著高于癌旁組織(P<0.05)。見表2。

表2 2組患者血清PCDH10 mRNA表達量比較

2.3 NQO1基因多態性與吸煙胃癌患者Logistic回歸分析 Logistic回歸分析結果顯示NQO1基因多態性與吸煙胃癌患者之間存在密切相關性(P<0.05)。吸煙組胃癌患者攜帶NQO1CT和TT基因型的概率明顯高于不吸煙組(P<0.05)。見表3。

表3 NQO1基因多態性與吸煙胃癌患者Logistic回歸分析

2.4 胃癌患者ESD術后復發影響因素分析 隨訪1年后失訪患者6例(死亡1例，隨訪資料不完整5例)，共有196例患者納入研究分析。其中65例患者胃癌復發，131例患者未復發。分析結果顯示：ESD術后是否發生胃癌復發與患者性別、年齡、病理類型以及分期無顯著關系(P>0.05)；而術后發生胃癌復發患者DCL-1陰性、胃癌組織PCDH10 mRNA水平以及NQO1基因CT和TT型比例均顯著高于未復發組患者(P<0.05)。見表4。

表4 胃癌患者ESD術后復發影響因素分析 例

2.5 影響胃癌患者ESD術后復發的多因素分析 將表5中對于胃癌患者ESD術后復發具有統計學意義的影響因素進行Logistic回歸分析，發現DCL-1陰性率、胃癌組織PCDH10 mRNA水平以及NQO1基因多態性均與胃癌患者ESD術后復發存在密切相關性(P<0.05)。見表5。

表5 影響胃癌患者ESD術后復發的多因素分析

3 討論

胃癌是臨床常見的消化道惡性腫瘤之一，發病率和病死率均較高，且目前我國胃癌發病人數呈逐漸上升和年輕化趨勢，對患者健康造成嚴重威脅[9]。ESD作為目前臨床上治療胃癌的微創手術，其相比傳統開放性術式具有創傷更小、患者恢復時間短等優勢，深受患者和醫生歡迎，但部分患者在行ESD術后發生復發仍是一個不容忽視的問題[10]。吸煙作為腫瘤常見危險因素和影響腫瘤預后的獨立因素，近來有研究證實吸煙與多種腫瘤易感基因多態性存在交互效應，即吸煙等危險環境因素會放大基因突變對腫瘤發生發展的影響[11]。

NQO1是人體內較為重要的Ⅱ相反應酶之一，可以通過促進還原反應發生減輕醌類等有害化合物對機體細胞的致癌致畸作用。已有的研究證實，NQO1基因存在多態性，且突變型基因(CT或TT)形成的蛋白產物穩定性不佳，會快速發生降解，且若其為純合突變基因型(TT)則穩定性更差[12]。陳道俊等[13]研究結果表明NQO1基因多態性與吸煙存在交互作用，且發生純合突變的NQO1 TT1型者吸煙對胃癌的影響效應更加嚴重。本文研究結果顯示，NQO1基因多態性與吸煙胃癌患者之間存在密切相關性(P<0.05)。吸煙組胃癌患者攜帶NQ01CT和TT基因型的概率明顯高于不吸煙組患者，差異有統計學意義(P<0.05)。且預后研究結果顯示術后發生胃癌復發患者的NQO1基因CT和TT型比例均顯著高于未復發組患者(P<0.05)，NQO1基因多態性均與胃癌患者ESD術后復發存在密切相關性(P<0.05)。推測原因主要是由于NQOI CT、TT基因型屬于胃癌易感基因類型，該基因型攜帶者本身發生胃癌風險相對于CC型更高，而吸煙作為誘導因素，可能會促進NQO1 基因發生CT或TT基因突變，且發生突變后其與對基因突變的交互作用會進一步影響和加劇胃癌的發生發展，從而影響患者預后和術后復發情況[14]。

腫瘤發生的重要機制是機體癌基因激活和抑癌基因失活之間的平衡被打破。DLC-1是表達于人體正常組織中的一種抑癌基因；有研究證實，DLC-1在多種腫瘤組織中表現為低表達甚至缺失[4]。本研究結果表明，吸煙組患者DLC-1陽性表達患者比例顯著低于不吸煙組患者，二者差異有統計學意義(P<0.05)。且DLC-1在正常胃組織、癌旁組織和癌組織中表達水平分別呈現高表達、中表達、低表達，免疫反應性逐漸減弱。且預后研究Logistic回歸分析發現DCL-1陰性與胃癌患者ESD術后復發存在密切相關性(P<0.05)。黃永平等[15]研究結果說明DLC-1表達水平與腫瘤分期和惡性程度存在密切聯系，一般DLC-1陰性表達者惡性程度更高。而腫瘤N分期、LNR作為腫瘤預后重要判斷指標，會嚴重影響腫瘤預后。同時有研究表明DLC-1 mRNA雖然也會在正常組織中表達，但啟動子區域不會發生無甲基化，而DLC-1 mRNA 在胃癌組織中表現為低表達甚至不表達，且甲基化陳程度高達35%左右[11]。說明DLC-1 mRNA 表達量與DLC-1啟動子的過度甲基化程度存在顯著負相關性[16]。Sotillos等[17]研究進一步表明啟動子區域高甲基化可能會增加多種癌細胞如結直腸癌、肝癌以及胃癌等DLC-1基因失活的概率。以上研究均說明了DLC-1在各類癌組織中更傾向于陰性表達，而吸煙作為胃癌獨立危險因素，可能是通過誘導DLC-1啟動子區域甲基化加劇了DLC-1mRNA陰性表達，從而對患者預后造成不良影響。

PC-DH10作為惡性腫瘤相關基因之一，其在多種惡性腫瘤發展進程中可以發揮抑制癌細胞侵襲和轉移作用。劉培根[18]研究報道PC-DH10基因的啟動子區域會發生過度甲基化現象，而腫瘤發生增殖時，啟動子區域的過度甲基化會促進 miRNA轉錄。本文研究結果顯示吸煙組患者PCDH10 mRNA表達量顯著高于不吸煙組(P<0.05)，且2組患者胃癌組織PC-DH10 mRNA表達量顯著高于癌旁組織(P<0.05)；Logistic回歸分析發現胃癌組織PC-DH10 mRNA水平與胃癌患者ESD術后復發存在顯著相關性(P<0.05)。而林瑩等[19]研究結果顯示胃癌病灶內PCDH10的mRNA表達水平反而低于癌旁組織。Shishodia等[20]研究表明乳腺癌患者中乳腺癌組織的PCDH家族中的PCDH7基因表達水平顯著高于正常患者和癌旁組織。說明關于PC-DH10對于腫瘤發生發展作用機制尚未完全揭示，其與腫瘤預后之間的關系需要進一步深入研究證實，且PC-DH10家族中各亞型基因對腫瘤作用機制可能不完全相同。

綜上所述，NQOI基因多態性、DLC-1陰性和PCDH10高表達以及吸煙會增加胃癌的發生風險，且DLC-1陰性與胃癌ESD術后復發存在顯著負相關，PCDH10表達水平和NQO1基因多態性及吸煙與胃癌ESD術后復發存在顯著正相關。