6種臨床常用藥物對耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的體外抗菌作用

黃曉燕，甘燕玲，曹玲，陳麗丹，王露霞

（中國人民解放軍南部戰區總醫院檢驗科，廣東廣州 510010）

隨著碳青霉烯酶類抗生素使用的增多，導致耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（CRKP）出現并呈明顯上升趨勢，成為臨床治療感染的新挑戰。目前對CRKP感染治療有效的藥物種類有限，臨床常采用聯合用藥治療的方案，因此，臨床治療策略的可行性分析，尤其是治療藥物的最佳搭配方案值得探索。本文選取臨床常用抗生素對CRKP進行體外抗菌活性研究，為臨床治療提供實驗依據。

1 材料、儀器與試劑

1.1 菌株

收集廣州地區某三甲醫院2018年10月?2019年9月臨床分離的616株非重復肺炎克雷伯菌，篩選出CRKP37株。其中來源于痰液（包含肺泡灌洗液）25（68%）株、血液5（13%）株、中段尿3（8%）株、引流液2（5%）株、腦脊液1（3%）株、膿液化1（3%）株；標本主要分布在ICU 13（35%）株、老年ICU 10（27%）株、呼吸內科6（16%）株、神經外科4（11%）株、泌尿外科3（8%）株以及血液科1（3%）株。質控菌株大腸埃希菌ATCC8739，購自中國工業微生物菌種保藏管理中心。

1.2 儀器與試劑

運用VITEK MSIVD3.0質譜儀及其配套靶板、基質液（法國生物梅里埃）；Vitek2 Compect鑒定藥敏分析系統及其配套藥敏卡（法國生物梅埃）；BIORAD基因擴增儀（美國伯樂）；DYY-6C型瓊脂糖水平電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；Gel DOCTMXR+凝膠成像系統（美國伯樂）；DNA定量marker（北京天根生化科技有限公司）；核酸染料（北京天根生化科技有限公司）；瓊脂糖（西班牙Biow‐est）；96孔平底培養板（無錫耐思生物科技有限公司）；Muller-Hinton（MH）瓊脂培養基（廣州迪景生物技術有限公司）；Muller-Hinton（MH）肉湯（美國Difco公司）；CAMHB肉湯干粉；多黏菌素B、亞胺培南、米諾環素、磷霉素、多西環素藥敏紙片（英國OXOID）；替加環素（上海阿拉丁生化科技有限公司）。

2 方法

2.1 可疑產碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的篩選

運用VITEK MSIVD3.0質譜儀鑒定到種，使用Vitek2 Compect鑒定藥敏分析系統挑選對美羅培南或亞胺培南耐藥的肺炎克雷伯菌株，采用手工K-B法復檢，儀器法及手工法均耐藥者采用改良Hodge試驗進行耐藥表型確認。

2.2 改良Hodge試驗

用無菌生理鹽水制備0.5麥氏單位的大腸埃希菌ATCC25922懸液，10倍稀釋后均勻涂布于MH平板，在平板中心貼厄他培南紙片。挑取3～5個血平板上過夜培養的新鮮待測菌和質控菌株肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705菌落，垂直于紙片邊緣向外劃一條20～25 mm的直線，孵育后觀察結果，待測菌株與抑菌環交叉處出現矢狀生長的為產碳青霉烯酶陽性株［1］。

2.3 CRKP基因組DNA模板的提取

采用熱激法制備CRKP的DNA模板[2]：用無菌棉簽將分離純化的細菌洗脫到200μL無菌蒸餾水中，并置于?20℃冰箱中1 min。取出后，將其放入預先準備的100℃金屬水浴鍋中,靜置10 min，然后置于?20℃中保持1 min，然后離心（10 000 r/min）10 min使被裂解的細菌沉淀下來，將上清吸取到新的EP管中，該上清液即為提取的DNA模板溶液，將樣品儲存在?20℃冰箱中以備后用。

2.4 肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的擴增

使用PCR技術同時擴增肺炎克雷伯菌的5種碳青霉烯酶基因KPC、IMP、VIM、NDM-1、OXA-48并鑒定。PCR擴增體系（20μL）：DNA模板1μL，上下游引物各1μL，5×PCR mix 10μL，去離子水7μL。PCR反應條件：94℃預變性30 s，94℃變性30 s，KPC、IMP、OXA、VIM、NDM5個基因在各自相對應的退火溫度退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環之后72℃徹底延伸5 min。所用引物見表1。

表1 肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因引物序列和預計片段大小Table 1 Primer sequence and predicted fragment size of carbapenemase gene of Klebsiella pneumoniae

2.5 肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因擴增片段電泳鑒定

用980 mL的去離子水與20 mL的50×TAE原液混合，稀釋至1×TAE緩沖液，以配置2%瓊脂糖凝膠和電泳液。反應結束后，按順序在泳道內分別加入10μL PCR產物，電壓設置為100 V，由負極向正極電泳30 min。電泳結束后，把凝膠放置在紫外光下，用Gel DOCTMXR+凝膠成像系統觀察結果并拍照保存。

2.6 單獨藥敏試驗

采用微量肉湯稀釋法分別測定6種不同梯度濃度藥物對CRKP的體外最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)，記錄結果。判斷標準參照CLSIM07-A10版，檢測時在肉湯培養基中加入25 mg/L的6-磷酸葡萄糖。

2.7 聯合藥敏實驗

采用微量棋盤法，用96孔板進行實驗，把多黏菌素B、亞胺培南、米諾環素、替加環素、磷霉素、多西環素（分別以A、B、C、D、E表示）組合成15個不同藥物組：A+B、A+C、A+D、A+E、A+F、B+C、B+D、B+E、B+F、C+D、C+E、C+F、D+E、D+F、E+F，檢測各藥物組MIC聯合；同時設定生長對照（只加200μL菌懸液，無藥物）和無菌對照（只加200μL肉湯，無細菌）。每個組合各取相應藥物50μL，按不同梯度濃度加入96孔板，充分混勻，把濃度為1×106CFU/mL的肺炎克雷伯菌懸液100μL加入所有孔中，使菌液終濃度大約為5×105CFU/mL，充分混勻，置35℃培養箱20 h，記錄MIC聯合，計算部分抑菌指數（fractitional inhibitory concentration index,FICI）作為聯合藥敏試驗結果的判斷依據[3]：FICI=MICA聯合/MICA單用+MIC聯合/MICB單用，FICI≤0.5，協同作用；0.52.0，拮抗作用。

3 結果

3.1 藥物敏感試驗結果

結果見圖1。37株CRKP菌均為多重耐藥菌，對碳青霉烯類、頭孢菌素類、氟喹諾酮類藥物具有極高的耐藥率，均≥80%；對四環素類的多西環素、米諾環素以及氨基糖苷類的阿米卡星、氟喹諾酮類的左氧氟沙星的耐藥率是72.2%～79.4%；對添加酶抑制劑的抗生素呈現中敏或高耐，為53.8%～97.9%；對復方新諾明表現為中敏（敏感率57.7%)；對多黏菌素B及替加環素則呈高度敏感（敏感率92.8%、87.8%）。

圖1 CRKP藥敏結果Figure 1 Drug sensitivity of CRKPstrains(%)

3.2 耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌耐藥基因檢測結果

PCR擴增及瓊脂糖凝膠電泳結果表明37株菌都是CRKP。見圖2。

圖2 部分瓊脂糖凝膠電泳結果Figure 2 Agarose gel electrophoresis results

3.3 抗菌藥物單獨及聯用對CRKP的體外抗菌作用

3.3.1 實驗數據 15種藥物組合的MIC聯合均比MIC單獨值低，見表2。

表2 不同藥物單用及聯用對CRKP的MIC值Table 2 MICvalues of CRKPin single and combined use of drugs ρ/（μg·mL?1)

3.3.2 計算FICI、數據分析 見表3。結果6種藥物相互聯合，有協同作用株藥物組合的有A+D:13.51%（5/37株），A+E:40.54%（15/37株），B+C:13.51%（5/37株），B+E:75.68%（28/37株），B+F:5.41%（2/37株），C+E:8.11%（3/37株），D+E:16.22%（6/37株），E+F:5.41%（2/37株）；有拮抗作用為A+B:24.32%（9/37株），A+F:27.03%（10/37株），B+C:8.11%（3/37株），B+D:70.27%（26/37株），B+E:8.11%（3/37株），B+F:54.05%（20/37株），C+D:5.41%（2/37株），C+E:13.51%（5/37株），D+E:2.7%（1/37株），E+F:2.7%（1/37株）；其余表現為相加或無關。

表3 CRKP體外聯合藥敏試驗結果Table 3 Results of combined drugs sensitivity test of CRKP in vitro（n=37)

4 討論

CRKP感染的危險因素包括入住ICU（病情重、住院時間長、免疫力低下、多行開創性治療）、侵入性操作(有創呼吸機、深靜脈置管、尿道插管)、年齡（老年人、新生兒）、合并感染及碳青霉烯類抗菌藥物的廣泛使用等。目前，對CRKP敏感的藥物僅有氨基糖苷類(尤其是慶大霉素)、氨曲南、多黏菌素B、磷霉素及替加環素，但臨床治療沒有明確的方案[4-5]，碳青霉烯類藥物仍是治療產超廣譜β-內酰胺酶細菌的首選抗生素[6]，進一步導致了碳青霉烯類耐藥菌株的出現[7]。據統計，替加環素、多黏菌素對碳青霉烯耐藥菌株具有抗菌活性[8]，但單一用藥可使病原菌耐藥性逐漸增加[9]。有文獻報道，磷霉素聯合多黏菌素B聯合使用，可殺滅65%以上的CRKP，磷霉素不推薦單獨使用[10]。也有研究表明，無論是在院病死率、細菌清除失敗率和14 d累積生存率，聯合用藥效果均優于單藥（P<0.05）[11]。但目前臨床不同藥物組合的抗菌療效少有報道，并不確切。因此，本研究通過實驗評價臨床上6種常見抗菌藥物在單用或聯用對CRKP的體外抗菌活性，為臨床用藥提供參考或依據。結果顯示：最優給藥方案是多黏菌素B及亞胺培南分別與磷霉素聯合，具有顯著的協同作用（分別占40.54%和75.68%），這與回顧性研究報道一致[12]。但同時也檢測出亞胺培南分別與替加環素及多西環素聯合具有明顯的拮抗作用（分別占70.27%和54.05%），提示臨床用藥應避免使用此兩種組合給藥方案。另外，本實驗中亞胺培南聯合替加環素應用無協同作用，與Munoz-Price等[13]報道的應用此組合成功治療CRKP感染病例結果不符，可能是替加環素起到主要抗菌活性作用，碳青霉烯類藥物的協同作用仍不清楚。國內外文獻中尚未有關于上述3種抗菌藥物組合對CRKP的體外抗菌作用的報道，可能是考慮到3種藥物聯用可能產生的肝、腎毒性過大。目前，市面上熱門的新型酶抑制劑復合頭孢他啶/阿維巴坦(CAZ/AVI)，是廣譜β-內酰胺酶抑制劑阿維巴坦和第三代頭孢菌素相結合的抗生素，可抑制ESBLs及AmpC酶、KPC酶和部分D類β-內酰胺酶，抑菌活性雖然弱于替加環素和多黏菌素B，但明顯優于美羅培南、亞胺培南、厄他培南、多利培南[14]，具有較好的應用前景。