柳州地區部分孕產婦B族鏈球菌的耐藥性與分子特征分析

陳燕群 1,陳繼昌 2,吳宇碧

（柳州市婦幼保健院 1.檢驗科；2.新生兒科；3.產科，廣西柳州 545001）

B族鏈球菌（group BStreptococcus，GBS）在正常情況下可定植于孕產婦的生殖道，約10%的孕產婦生殖道可檢出GBS[1]。GBS是一種機會性病原體，可在分娩前或分娩時通過垂直傳播感染新生兒，導致發生早發型GBS感染（early-onset group B streptococcus，EOGBS）等，此類感染與新生兒的感染性疾病發病率與死亡率高度相關[2?3]。產前抗生素預防（intrapartum antibiotic prophylaxis，IAP）對新生兒的管理非常重要，因而需要對產前GBS陽性菌株進行抗菌藥物敏感性試驗以選擇敏感藥物進行預防性用藥[2]。此外，GBS擁有大量毒力因子，可附著于宿主細胞，從而導致宿主發生侵襲或定植，從而導致疾病進一步進展[3?4]。為全面了解本地區從孕產婦樣本分離的GBS菌株抗菌藥物敏感性、毒力基因和耐藥基因的分布情況，我院對分離的96株菌株進行了相關的流行病學調查和實驗室檢測，現將結果報告如下。

1 研究方法

1.1 研究人群和樣本收集

收集2019年1月?8月在我院分娩的、分娩前2周內無抗菌藥物使用情況，且無發生急性、明顯性感染孕產婦1 452名，納入和排除標準參照文獻[5]的標準進行。在分娩前，采集陰道分泌物，半小時內送至檢驗科微生物室進行處理。上述樣本監測和采集的過程，獲得柳州市婦幼保健院倫理委員會的批準，批文為（20170010）。

1.2 GBS的分離鑒定

將陰道分泌物拭子轉種至GBS顯色鑒定培養基中，在35～37℃的培養箱中培養18～24 h，將顯色陽性的菌落（經顯色后出現紅色、粉紅色或淺紫色）經進一步的革蘭染色和過氧化氫酶實驗確定為可疑陽性后，轉種至哥倫比亞羊血培養皿中進行CAMP試驗，觀察溶血環狀態，鑒定分離株為GBS后行抗菌藥物敏感性試驗和分子生物學分析。

1.3 抗菌藥物敏感性試驗

取陽性純培養菌落，使用微量稀釋法試驗對GBS菌株進行藥物敏感性分析，按照卡片的說明書操作進行。折點的判讀基于美國臨床與實驗室標準化委員會提供的判讀標準進行判讀。對于青霉素耐藥菌株，進一步使用E-tes t方法進行復核。抗菌藥物多重耐藥（multidrug resistance，MDR）的判定標準為對≥3種不同種類的抗菌藥物同時產生耐藥[6]。

1.4 耐藥基因和毒力基因檢測

取純培養菌落，提取DNA后，采用聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）方法檢測大環內酯類、四環素類和林可酰胺類抗菌藥物的耐藥基因：ermA、ermB、ermTR、mefA/E、tetM、tetO、tetL、tetK、tetT、tetS和linB。采用PCR方法檢測GBS的毒力基因（alp表面定位蛋白抗原基因，alp2/3、alphaC、rib和epsilon），耐藥基因和毒力基因檢測的方法和試劑盒的使用均參照文獻[7]進行。

1.5 實驗試劑及儀器

GBS顯色鑒定培養基和哥倫比亞羊血培養皿均購自鄭州安圖生物工程股份有限公司，規格為90 mm。菌株藥敏實驗儀器選擇法國梅里埃的VITEK COMPACT 2，藥敏卡片選擇GP67卡。

1.6 統計學分析

采用IBMSPSS 23.0軟件對數據進行分析，連續型數據用x±s表示，采用t檢驗進行分析。計數資料和率的差異采用χ2檢驗或Fisher’s精確檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 孕產婦GBS定植的臨床特征分析

本研究最終納入了1 452名孕產婦檢測GBS，檢出96株GBS菌株，其陰道攜帶率為6.6%。在GBS檢出的陽性婦女群體，低分娩孕周與孕產婦妊娠合并癥/不良妊娠結局有關（P=0.004），見表1。

表1 孕產婦GBS定植的臨床特征分析Table 1 Analysis of clinical characteristics of GBSisolated in pregnant women[n(%)]

2.2 孕產婦GBS菌株的血清型與耐藥、毒力基因之間的關系分析

96例GBS菌株，共檢測出3種血清型，分別為Ⅰa（41.7%）、Ⅰb（22.9%）和Ⅲ型（35.4%）。GBS多重耐藥率為86.5%，菌株抗菌藥物耐藥率最高者為紅霉素（99.0%）、克林霉素（96.9%）、四環素（86.5%）和左氧氟沙星（65.6%），主要的耐藥模式為：紅霉素?克林霉素?四環素、紅霉素?克林霉素?四環素?左氧氟沙星、紅霉素?克林霉素?四環素?氯霉素、紅霉素?克林霉素?氯霉素等4種。其中氯霉素的耐藥率在3種血清型中的分布存在顯著差異，以Ⅰb型的耐藥率為最高（P=0.017）。alphaC基因在血清Ⅰa型菌株的陽性率最高（P<0.001），rib基因在血清型Ⅲ的菌株中陽性率最高（P<0.001），epsilon基因在血清型Ⅰb的菌株陽性率最高（P=0.015，具體見表2。

表2 孕產婦GBS菌株的血清型與耐藥、毒力基因之間的關系分析Table 2 Analysis of the relationship between the serotypes,drug resistance and virulence genes of GBSstrains isolated in pregnant women[n(%)]

2.3 GBS菌株血清型與毒力基因的對應分析

對應分析結果顯示，GBS菌株的毒力基因（alp表面定位蛋白抗原基因，alp2/3、alphaC、rib和epsi‐lon基因）檢出率與血清型分布存在差異性（χ2=56.78，P<0.001）。表現為血清型Ⅲ菌株更容易攜帶毒力基因rib，血清型Ⅰa菌株更容易攜帶毒力基因alphaC，血清型Ⅰb菌株更容易攜帶毒力基因epsi‐lon，見圖1。

圖1 GBS菌株血清型與毒力基因分布的對應分析Figure 1 Correspondence analysis of GBS strain serotypes and virulence gene distribution

3 討論

GBS是新生兒疾病發生和死亡的主要致病原因之一，尤其在出生后的1周內[8]。全球范圍內每年至少有350萬早產發生的主要原因可歸因于母親GBS感染/定植。在中低收入國家，報告的GBS發病率數據更容易產生報告偏倚/發表偏倚。在亞洲，這個數據更是被嚴重低估。在一個成本效益建模報告中，披露的數據表明，亞洲EOGBS發病絕對數很高，但母親GBS定植率較低，表明疾病的發病率被嚴重低估。文獻指出，這些差異有可能是因為在該地區流行的GBS菌株毒力很可能有所不同。一些文獻報道，與血清型Ⅲ密切相關的高毒力GBS菌株ST17既可能在孕產婦生殖道定植，也可能導致新生兒疾病的發生[8]。

IAP可預防每年3 000例新生兒的死亡[8]。本研究結果顯示，96株GBS菌株藥敏試驗數據結果不樂觀，有86.5%的菌株產生了多重耐藥，最常見的耐藥表型是紅霉素?克林霉素?四環素和紅霉素?克林霉素?四環素?左氧氟沙星。孕產婦中分離的GBS菌株對紅霉素、克林霉素和四環素的高耐藥率在國內也多次被報道[9?10]。國外研究顯示，GBS菌株對四環素的耐藥率高達94.9%[11]。且有15%的菌株對青霉素產生了耐藥性[11]，且菌株對β內酰胺類抗菌藥物的敏感性正在下降[12]。該研究發現從孕產婦陰道分泌物中分離出的GBS菌株中有30.8%對萬古霉素產生了耐藥性，且特定的血清型別與青霉素、萬古霉素的耐藥性存在高度相關性，如血清型別Ⅱ、V對青霉素的耐藥性分別為33%和27%，而Ⅴ型對萬古霉素的耐藥率高達45%[11]。本研究結果顯示，從孕產婦陰道分泌物樣本中分離的GBS菌株對β內酰胺類抗菌藥物均敏感，對利奈唑胺、萬古霉素和替加環素等均100%敏感，表明上述藥物仍可作為IAP的首選藥物。臨床使用抗菌藥物對有高危因素需進行產前抗生素預防用藥前，需進行皮試，對皮試結果陽性者，應使用敏感的抗菌藥物，達到預防的效果。

本研究結果顯示，在96株GBS菌株中，有57株菌株至少攜帶了1～3種大環內酯類耐藥性的基因。高攜帶率的ermB和mefA/E的結果表明此兩種耐藥基因可能是GBS對紅霉素產生耐藥性的主要原因之一。已有多篇文獻報道了誘導型大環內酯?林可酰胺?鏈霉菌素B（iMLSB）菌株同時攜帶ermB和mefA/E[13]。且該文獻結果顯示，ermTR和iMLSB高度相關。與上述研究結果相似，本研究結果顯示，40.6%（39/96）的菌株攜帶了ermB和mefA/E，且84.4%（81/96）的菌株表明GBS菌株的高耐藥基因陽性，凸顯了在日常工作中持續對四環素和紅霉素耐藥監測的必要性。

目前研制的疫苗中，若90%的母親接種GBS疫苗有80%左右的有效率，可保護約108 000名胎兒或新生兒免于死亡[11]。對本地區分離的GBS菌株進行持續性監測，可快速得知本土流行菌株的血清型，且為日后研制GBS疫苗提供依據。本研究結果顯示，本地流行的GBS菌株血清型只有3種，Ⅰa、Ⅰb和Ⅲ型（分別占41.7%、22.9%和35.4%），與國內華南地區的流行病學調查結果及與國外的研究不一致[9，11]，表明血清學分布具有地域性差異。正在研制的3聯苗（Ⅰa、Ⅰb和Ⅲ）血清覆蓋率達到100%，凸顯了早日引進該類疫苗到本地區進行接種的重要性。

已有較多文獻報道了GBS菌株的毒力基因在不同的血清型別中的差異性[14]。對GBS菌株進行持續性的監測可得知菌株的進化程度和遺傳背景差異性[15?17]。本研究針對常見的毒力基因（alp表面定位蛋白抗原基因，alp2/3、alphaC、rib和epsilon基因）進行檢測，結果顯示，GBS菌株對alp2/3、al‐phaC、rib和epsilon基因的攜帶率分別為3.1%、30.2%、32.3%和34.4%。且對應分析結果顯示，菌株的血清型別與alp表面蛋白抗原相關基因存在高度相關性。alp表面蛋白抗原相關疫苗（alphaC和rib）和3聯苗（alphaC、rib和epsilon）的覆蓋率分別為62.5%和96.9%，表明本土流行菌株的毒力基因與三聯苗覆蓋率高度吻合，引進alp表面蛋白抗原相關三聯苗亦可預防絕大多數GBS定植陽性的孕產婦通過垂直傳播將菌株傳染給新生兒，從而減少EOGBS和死胎死產等，其成本效益較好。

本研究對柳州地區圍產期孕產婦陰道定植的GBS菌株進行了抗菌藥物敏感性試驗、紅霉素和四環素耐藥基因檢測、菌株的血清分型，并對alp表面蛋白抗原相關基因進行了詳細分析，發現本地流行的GBS菌株大多呈現多重耐藥性，國際上正在研發的血清三聯苗（Ⅰa、Ⅰb和Ⅲ）和alp表面蛋白抗原相關三聯苗的覆蓋率分別達100%和96.9%。本研究結果表明，對本地區孕產婦進行持續性GBS篩查和監測的必要性，凸顯了及時對分離的GBS菌株進行血清分型和相關毒力基因監測的重要性。