浦江桃形李果實空腔的發(fā)育特性

謝小波，邱海萍，陳鴻才，王艷麗，鄭家祥

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院a園藝研究所，b植物保護與微生物研究所，浙江 杭州 310012；2.浦江縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，浙江 浦江 322200；3.浦江長豐果園種植有限公司，浙江 浦江 322200)

浦江桃形李屬中國李(PrunussalicinaL.)曾是浙江名果，主產(chǎn)于浙江浦江縣。其果頂尖圓，外形似桃，因而得名。浦江桃形李一般8月上中旬成熟，成熟時果粉較厚，果皮黃綠，果肉淡黃色，味甜微酸，略脆，口感上乘。經(jīng)低溫貯藏1周以上的果實，外觀色澤金黃，口感松軟，汁水豐富，帶香氣，甜度增加，非常爽口。浦江桃形李可溶性固形物含量較高，通常在15%以上；果形大，一級果單果重一般在100 g以上，普通果實也都在80 g以上；豐產(chǎn)性好，需要疏果[1]。

浦江桃形李一個重要特征為果實內(nèi)部有空腔，該空腔位于核尖周圍，在果實膨大過程中開始出現(xiàn)，隨著果實發(fā)育而增大。空腔表面粗糙，帶棕黃色，其形態(tài)與離核腔面較為光滑特性有所不同，空腔形狀一般呈不規(guī)則星形。浦江桃形李不同果實的核、肉分離程度不同，嚴(yán)重的約有2/3核表面與果肉分離，小部分果實除核尖一端有空腔外，在核底部也還會出現(xiàn)較小空腔。浦江桃形李無論外形和內(nèi)部空腔形態(tài)都與福建的木奈李非常相似，應(yīng)屬同一類型[2，3]。

浦江桃形李果實內(nèi)空腔形態(tài)及其對品質(zhì)的影響以往少有報道，本文特此對該特性進(jìn)行研究，現(xiàn)將有關(guān)結(jié)果總結(jié)如下。

1 材料與方法

1.1 材料

以浦江桃形李不同發(fā)育時期的果實為研究材料，以成熟期浦江桃形李果實作為空腔內(nèi)微生物培養(yǎng)材料。

1.2 方法

1.2.1 不同發(fā)育時期空腔動態(tài)變化

將不同發(fā)育時期的浦江桃形李果實從中間切開，觀察近核周圍空腔形成情況。用游標(biāo)卡尺測量果實的縱、橫徑及果實空腔縱、橫徑。

1.2.2 果肉切片番紅固綠染色

果實采樣后，將需要切片觀察的組織用2.5%戊二醛固定，于4 ℃保存，用于石蠟切片。固定后的樣品進(jìn)行石蠟切片制作，切片機為Leica RM2016，切片厚度設(shè)為4 μM。然后分別進(jìn)行番紅固綠染色和間苯三酚染色，再進(jìn)行顯微成像觀察。

番紅固綠染色方法。依次將切片放入二甲苯Ⅰ 20 min、二甲苯Ⅱ 20 min、無水乙醇Ⅰ10 min、無水乙醇Ⅱ 10 min、95%酒精5 min、90%酒精5 min、80%酒精5 min、70%酒精5 min、蒸餾水分別清洗，進(jìn)行切片脫蠟；脫蠟后，先在1%番紅染液中染色1～2 h，用水洗去多余染液，分別放入50%、70%、80%梯度酒精脫色各1 min；然后將切片放入0.5%固綠染液中染色30～60 s，無水乙醇I中脫色30 s、無水乙醇II中脫色1 min；最后切片于60 ℃烤箱烤干，并于二甲苯透明5 min，中性樹膠封片。

切片全景掃描成像方法和分析。番紅固綠染色切片用掃描儀Pannoramic MIDI(匈牙利3D HISTECH公司產(chǎn)品)掃描，按照說明書操作，掃描成像文件包含了完整組織信息。圖像文件用CaseViewer軟件讀取并可隨意放大至1 000倍。

1.2.3 果實空腔內(nèi)微生物培養(yǎng)與分離

無黑心果微生物培養(yǎng)。將預(yù)先冷藏的成熟浦江桃形李果實先用流水沖洗干凈，再用3%H2O2消毒、漂洗3 min，無菌水沖洗3～5次，無菌濾紙吸干表面水分。然后用無菌手術(shù)解剖刀將近核果肉切成0.5 cm×0.5 cm小塊，之后將消毒材料分別接種到PDA培養(yǎng)基中，每培養(yǎng)皿接種4塊或3塊，重復(fù)3次，果核單獨接種。在28 ℃恒溫培養(yǎng)3～5 d，觀察組織塊外圍的菌落培養(yǎng)情況。

黑心果微生物培養(yǎng)。前處理方法與無黑心果微生物培養(yǎng)相同。若有菌落形成，觀察其形態(tài)、顏色的差異及菌絲形狀等。采用菌絲末端分離法[4]，分別挑取不同菌落邊緣菌絲轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基平板上進(jìn)行純化培養(yǎng)，觀察記錄菌落的形態(tài)。純化后采用斜面保藏方法置于4 ℃下保藏，定期檢查。

1.2.4 黑心果實內(nèi)生真菌的分子生物學(xué)鑒定

將黑心果分離到的內(nèi)生真菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)一段時間后，從平板上刮取約0.1 g菌絲體，置于1.5 mL滅菌離心管中，按照Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，并以此為模板，通過通用引物ITS1和ITS4對菌株rDNA-ITS區(qū)域進(jìn)行擴增。PCR反應(yīng)體系(30 μL體系)：PCRmix7.5 μL，ITS1和ITS4各1.2 μL，模板DNA1.6 μL，雙蒸水補足30 μL。PCR擴增條件為94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性40 s，37 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共40個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠(DuRed核酸染料)電泳檢測，將擴增后的DNA交上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。測序獲得的ITS序列通過BLAST比對，根據(jù)同源性相似度差異，采用MEGA5鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，對分離菌株與數(shù)據(jù)庫中登錄的近源菌株系統(tǒng)發(fā)育樹關(guān)系進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 果實空腔發(fā)育動態(tài)

圖1顯示，將不同發(fā)育時期的浦江桃形李采樣后對半剖開觀察表明，浦江桃形李約在花后74 d左右開始出現(xiàn)核、肉分離現(xiàn)象，即在果實開始膨大初期，隨著果實發(fā)育，空腔會逐漸變大，到成熟時期(一般至8月上中旬)1/2～2/3核表面會發(fā)生核、肉分離現(xiàn)象，同時空腔內(nèi)常伴有白色透明結(jié)晶物沉積。此外，空腔大小與果形大小有關(guān)，一般果形小空腔也變小。不同果實空腔形成時間存在差異。

a—花后68 d；b—花后74 d；c—花后81 d；d—花后99 d；e—花后106 d；f—花后137 d。

2.2 果實縱橫徑比與果實空腔大小的關(guān)系

測量多點生長浦江桃形李成熟果實縱、橫徑，果實縱、橫徑分別為57.9±4.4和54.6±3.3 cm，縱、橫徑比值為1.06±0.05；果實空腔縱、橫徑分別為17.9±8.6和22.1±6.4 cm。分析浦江桃形李果實縱橫比與空腔縱、橫徑的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為0.518和0.505，檢驗均達(dá)極水平顯著。分析結(jié)果表明，浦江桃形李果實縱橫比與其空腔大小成正相關(guān)。

2.3 果肉細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)觀察

采樣空腔形成后的浦江桃形李果實，與其相鄰種植無空心現(xiàn)象的芙蓉李作比較，對靠近核尖部位的果肉進(jìn)行切片，并用番紅固綠染色，然后對果肉細(xì)胞進(jìn)行顯微觀察。圖2顯示，靠近空腔的浦江桃形李果肉細(xì)胞壁基本沒有被染成紅色，說明其細(xì)胞沒有明顯木質(zhì)化現(xiàn)象。這與鮮食浦江桃形李的口感一致，即其果實空腔并不影響食用品質(zhì)，成熟時果肉口感仍然表現(xiàn)細(xì)膩、松脆，存放后松軟、多汁。

圖2 浦江桃形李果肉細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)觀察

2.4 果實空腔微生物培養(yǎng)與分離

將采樣的成熟時期浦江桃形李果實表面消毒后，對暴露在空腔中的果肉、果核進(jìn)行微生物培養(yǎng)。圖3表明，健康果實并未培養(yǎng)出微生物，但同樣果面完好的黑心果實培養(yǎng)出微生物。

圖3 浦江桃形李空腔內(nèi)物生物培養(yǎng)

經(jīng)初步鑒別，黑心果中分離到9種可能的致病性真菌，分屬Fusariumfujikuroi、Botryosphaeriadothidea、Moniliniafructicola、Phomopsissp等4個種。

3 討論

無論是黏核還是離核的李子品種，均發(fā)現(xiàn)部分果實存在不同程度的空腔現(xiàn)象，如浙江另一個著名地方李子品種嵊縣桃形李中也時有發(fā)現(xiàn)，但此類果實的空腔往往為個別現(xiàn)象，同品種中多數(shù)果實沒有空腔。因此，這類品種的果實空腔可能受生長環(huán)境影響。但浦江桃形李果實空腔普遍存在，若果形較小，則空腔相對也小；果形大，空腔則大，且空腔呈不規(guī)則星形。空腔縱、橫徑長度少則十幾毫米，多則三十幾毫米不等，其空腔比一般的李子品種都大。這種空腔李子在一定程度上影響其市場銷售，不明情況的消費者會誤認(rèn)為是壞果。更廣泛種植的木奈李(包括油木奈和青木奈)也面臨類似情況[5]。

浦江桃形李不同地理環(huán)境品質(zhì)有一定的差異[6]。因此，要在更適宜的土壤立地條件下種植，發(fā)揮其優(yōu)良口感特性，通過栽培措施培育出更好的品質(zhì)，彌補其存在空腔這一性狀的不足，同時加強地方特色品種宣傳，讓更多消費者了解其特性。目前已開展了海藻肥的試驗，初步結(jié)果表明，有較好效果，后續(xù)將繼續(xù)開展試驗，總結(jié)出配套的栽培措施。