UPLC-MS/MS法測定水產品中15種氟喹諾酮類獸藥殘留

虞冰，劉莉，吾建祥，楊德毅，馬婧妤

(金華市農產品質量安全中心，浙江 金華 321017)

氟喹諾酮類藥物(FQs)是一類全合成廣譜抗菌藥，廣泛用于人和動物的疾病治療，具有高效、廣譜、低毒等特點，在畜牧養殖業中廣泛用于預防和治療動物疾病[1-2]。FQs藥物長期使用會于動物體內蓄積，影響到人類的健康，會對人體的心血管系統及中樞神經系統造成不良影響，可導致呼吸肌無力，重癥肌無力，甚至危及生命[3]。動物性食品中低濃度的FQs殘留易產生耐藥性菌株，致使有效使用劑量增加。本文借鑒標準規定和相關文獻的前處理方法[4-7]，建立高效液相色譜-串聯質譜法(UPLC-MS/MS)，用于同時測定水產品中15種FQs殘留，在試樣的提取、高效液相色譜和質譜的檢測條件方面進行優化，旨在為氟喹諾酮類獸藥殘留檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

水產品(鯽魚)采購于金華市各地市養殖企業。98.48%氟羅沙星、95.71%氧氟沙星、97.49%諾氟沙星、97.51%依諾沙星、92.31%環丙沙星、99.90%恩諾沙星、99.42%洛美沙星、99.90%丹諾沙星、97.50%奧比沙星、96.80%雙氟沙星、85.92%沙拉沙星、99.00%司帕沙星、98.20%噁喹酸、99.30%氟甲喹、92.19%培氟沙星均為標準品(北京振翔科技有限公司)；無水硫酸鈉、正己烷均為分析純；乙腈、甲酸為色譜純。試驗用水(一級水，電阻率為17.65 MΩ·cm)

LC-MS/MS8050超高效液相色譜-串聯質譜儀(日本島津公司)；高速離心機(日本日立公司)；BSA2202S電子天平(德國賽多利斯公司)；BSA224S電子天平(德國賽多利斯公司)；渦旋振蕩器(德國IKA)；均質器(新銳精儀)；旋轉蒸發儀(Heidolph)；臺式離心機(上海安亭)。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱為C18柱，MGⅡ，2.1 mm×150 mm，5 μm，或相當者；流動相A相為0.1%甲酸溶液(含5.0 mmol·L-1醋酸銨)，B相為甲醇，C相為乙腈；流速為0.20 mL·min-1；柱溫為室溫；進樣量10 μL；洗脫方式為梯度洗脫。梯度洗脫條件見表1。

表1 液相色譜流動相洗脫條件

1.2.2 質譜條件

離子化模式為電噴霧離子源(ESI)、正離子模式；噴霧電壓為4 500 V；霧化氣壓力為12 L·min-1；輔助氣流量為2 L·min-1；離子傳輸管溫度350 ℃；源內碰撞誘導解離電壓為10 V；掃描模式：選擇反應監測(SRM)，選擇反應監測母離子、子離子和碰撞能量(表2)。

表2 選擇反應監測母離子、子離子和碰撞能量

1.2.3 儲備液配制

稱取99.90%恩諾沙星、99.90%丹諾沙星各10.01 mg，98.48%氟羅沙星10.15 mg，95.71%氧氟沙星10.45 mg，97.49%諾氟沙星10.26 mg，97.51%依諾沙星10.26 mg，92.31%環丙沙星10.83 mg，99.42%洛美沙星10.06 mg，97.50%奧比沙星10.26 mg，96.80%雙氟沙星10.33 mg，85.92%沙拉沙星11.64 mg，99.00%司帕沙星10.10 mg，98.20%噁喹酸10.18 mg，99.30%氟甲喹10.07 mg，92.19%培氟沙星10.85 mg。

1.2.4 樣品前處理

稱取(5±0.02)g試樣，于50 mL具塞離心管中。加入5 g無水硫酸鈉，加入鋼珠，再加入20 mL乙腈，放入均質器內勻漿。以4 000 r·min-110 ℃離心5 min，取上清液于50 mL梨形瓶中。殘渣中再加入20 mL乙腈，重復提取1次，合并2次提取液。在梨形瓶中加入5 mL異丙醇，用旋轉蒸發儀于50 ℃水浴濃縮蒸發至干。準確加入2 mL流動相(甲醇∶水=1∶1)，再將梨形瓶進行超聲溶解殘渣，將混合液轉移至5 mL離心管中，加2 mL正己烷至梨形瓶中，超聲溶解，轉移至上述離心管。將5 mL離心管中的混合液渦旋，以4 000 r·min-1離心5 min，去上層液體。如果試樣分層不明顯，油脂渾濁，再加1 mL正己烷，重復凈化，直至下層液體澄清。取下層清液，過0.2 μm濾膜，裝入進樣瓶，并在進樣瓶上寫上編號，用液相色譜-串聯質譜儀測定。

1.2.5 計算與表述

計算氟喹諾酮類獸藥殘留量公式:

Xi=ciV/m。

式中，Xi為樣品中喹諾酮類藥物殘留的含量(μg·kg-1)；ci為樣品制備液中氟喹諾酮類藥物殘留的濃度(ng·mL-1)；V為最終定容體積(mL)；m為樣品稱樣量(g)。保留3位有效數字。

2 結果與分析

2.1 標準曲線、線性范圍和檢出限

取適量的標注儲備液，用流動相初始溶液對15種氟喹諾酮類藥物標準儲備液進行稀釋，形成系列濃度為2、5、10、20、50、80 ng·mL-1的標準工作溶液。濃度從低到高依次進樣測定，每個濃度進樣3次。以離子色譜峰面積為縱坐標、相應的溶液濃度為橫坐標作圖，得到相應氟喹諾酮類藥物的標準曲線。15種氟喹諾酮類藥物在5～80 ng·mL-1濃度范圍內，呈良好線性關系，線性回歸方程、相關系數見表3。

表3 15種氟喹諾酮類藥物標準曲線及相關系數

將適量的標準工作溶液加到空白試樣中，按照1.2.4節的試驗方法處理以后，用UPLC-MS/MS進行檢測。通過計算本試驗方法，檢出限(LOD，S/N>3)為1.0 μg·kg-1，定量限(LOQ，S/N>10)為2.0 μg·kg-1。

2.2 精密度和回收率

量取20、100、200 μL對照工作液加到5 g樣品中，添加濃度3個平行，每份樣品測定3次，取平均值，計算回收率和相對標準偏差(RSD)。由表4可知，試樣中15種氟喹諾酮類獸藥添加樣品的回收率在77.33%～100.30%之間。回收率和RSD均達到良好要求。

表4 禽蛋中8中氟喹諾酮類獸藥回收率和標準偏差

3 小結

本文建立了水產品中15種氟喹諾酮類獸藥殘留檢測的超高效液相色譜-串聯質譜法(UPLC-MS/MS)測定方法，該方法與普通液相色譜法相比，定性定量更準確，檢測速度提升，分離時間縮短，方法的靈敏度和分離度及重現性較好，穩定性高，滿足水產品中氟喹諾酮類藥物殘留分析的檢測要求，同時溶劑用量大為減少，降低了分析成本，使檢測效率得到提升，可以用來監控水產品中15種氟喹諾酮類藥物的殘留量。